淫羊藿苷通過調控中樞CRF和HPA軸影響抑郁動物模型神經內分泌系統功能*

劉運琴,戢漢斌,肖文昊,林 麗

(1.武漢市武東醫院/武漢市第二精神病院精神科,武漢 430084;2.武漢市武東醫院/ 武漢市第二精神病院精神康復科,武漢 430084;3.武漢市武東醫院/武漢市 第二精神病院老年精神科,武漢 430084;4.湖北中醫藥大學基礎醫學院 分子細胞生物學實驗室,武漢 430065)

抑郁癥是一組以持續心境低落、興趣減退為主要特征的綜合征,常伴有認知功能損害、飲食睡眠障礙、抑制活動減退及各種軀體癥狀,是全球范圍內的常見精神障礙性疾病[1]。近年來抑郁癥的發病呈現逐年升高的趨勢,WHO預測抑郁癥可能成為僅次于心血管疾病的人類第二大致殘因素[2]。盡管有大量研究從各個方面對抑郁癥的發病原因及機制進行了研究,但目前抑郁癥的發病機制仍沒有準確的定論。探討抑郁癥的發病機制、早期診斷并給予有效治療成為國內外學者研究的重點[3]。淫羊藿苷是淫羊藿有效成分的活性單體,具有提高心腦血管血流量、促進造血、骨代謝及延緩衰老等功能[4]。近年來研究發現,淫羊藿苷可穿透血腦屏障發揮抗神經元損傷、促神經突觸生長、提高性功能和抗抑郁等作用[5]。張聰等[6]研究發現,淫羊藿苷顯著增加皮質酮誘導的抑郁大鼠蔗糖攝入量和海馬腦源性神經營養因子(BDNF)水平,降低了強迫游泳實驗(forced swim test,FST)的不動時間,具有較強的抗抑郁活性,但其對神經內分泌系統的影響尚不明確。本實驗以80只清潔級SD小鼠為觀察對象,旨在分析淫羊藿苷影響抑郁動物模型神經內分泌系統功能及其相關機制，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選擇清潔級SD小鼠80只,雄性,8周齡,由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供,實驗動物許可證號：SCXK(京)2012-0001。(23±2)℃、(55±2)%濕度的相對恒定飼養環境,光暗周期為12 h,環境保持安靜。本實驗動物實驗操作均符合《實驗動物管理條例》相關標準。淫羊藿苷(純度>98%)由上海市融禾醫藥公司提供。

1.2 方法

1.2.1分組

將SD小鼠隨機分為對照組、模型組、低劑量組及高劑量組,其中模型組、低劑量組及高劑量組建立社交應激抑郁模型,對照組不予處理。

1.2.2社交應激抑郁模型建立

以CD1小鼠為定居者,單籠飼養2周。SD小鼠為入侵者,放入定居者的籠子里,為保護自己的領地,定居者會撕咬入侵者,10 min后將定居者與入侵者用帶孔的有機玻璃擋板分開,在同一籠子里相處1 d,讓入侵者感受到來自定居者的視覺及聽覺威脅,而非撕咬。之后將入侵者送入新的定居者籠子里,重復上述操作10 d。最后將SD小鼠單籠飼養,對其進行社交孤立28 d。

1.2.3給藥

社交應激10 d后,低劑量組及高劑量組分別給予30、60 mg/kg淫羊藿苷灌胃,對照組及模型組分別給予生理鹽水灌胃,給藥28 d。

1.3 觀察指標

1.3.1社區區域停留時間

在給藥28 d后每籠放入新的CD1小鼠,對其進行社會應激,觀察并比較各組小鼠社區區域停留時間。

1.3.2曠場試驗

在安靜室內將小鼠放置于敞箱底面的中心方格內,記錄小鼠在5 min中的運動,以穿越底面塊數為水平穿越格數,觀察各組小鼠水平穿越格數。

1.3.3體重檢測

測量小鼠試驗后的體重,計算并比較各組小鼠體重水平。

1.3.4血清檢測

從心臟采血,于室溫靜置20 min,以4 000 r/min的轉速離心10 min,小心分離血清,放入-70 ℃環境冷藏備用,避免反復凍融。采用酶聯免疫吸附試驗檢測血清白細胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)水平。

1.3.5下丘腦促腎上腺皮質激素釋放激素 (corticotropin releasing hormone,CRF)水平檢測

給藥第28天治療結束后24 h,將小鼠快速斷頭取下丘腦,稱重后放入1 mL生理鹽水中煮沸3 min,于勻漿器中均漿,4 ℃ 3 000 r/min離心10 min,取上清液按照CRF放免試劑盒說明書進行操作,檢測各組小鼠CRF水平。

1.3.6垂體中促腎上腺皮質激素(adrenocorticotropic hormone,ACTH)及腎上腺皮質肌動蛋白(actin of adrenal cortex,CORT)水平檢測

給藥第28天治療結束后24 h,將小鼠快速斷頭取垂體及腎上腺,稱重后放入含10% EDTA-Na230 μL的試管中,于勻漿器中均漿,4 ℃ 3 000 r/min離心10 min,取上清液按照ACTH、CORT試劑盒說明書進行操作,檢測各組小鼠ACTH、CORT水平。

1.3.7放射性配基檢測糖皮質激素受體(GR)最大結合容量

分離各組小鼠肝臟,PBS沖洗,剪碎、研磨,4 ℃ 175 000 g離心30 min,吸去上清液。BCA法測定蛋白濃度,調整蛋白濃度為10 mg/mL。加入5%的N,N′-二環己基碳二亞胺(DCC),冰浴3 min,4 ℃ 12 000 r/min離心3 min,吸去上清液。向總結合管和非特異性結合管中每管加入300 μL肝胞液,總結合管中加入[1,2,4-3H]-Dex,非特異結合管中加入[1,2,4-3H]-Dex及非標記Dex。吸上清液400 μL加入5 mL液體閃爍液后用液體閃爍儀測量各管的cpm值。Schatchard分析求得肝胞液GR與3H-Dex特異結合的最大結合容量。

1.3.8Western blot檢測GR蛋白表達

取各組小鼠肝組織,加入蛋白裂解液勻漿,冰上裂解,4 ℃ 12 000 r/min離心20 min,取上清液。BCA法定量總蛋白,SDS-PAGE電泳分離。轉印至硝酸纖維素膜,室溫封閉。加入GR一抗4 ℃過夜。HRP標記二抗,增強化學發光法顯色,曝光顯影。

1.4 統計學處理

2 結 果

2.1 各組小鼠行為學指標水平比較

模型組、低劑量組、高劑量組小鼠水平穿越格數、社區區域停留時間及體重明顯低于對照組,低劑量組和高劑量組小鼠水平穿越格數、社區區域停留時間及體重明顯高于模型組,且隨劑量的增加而升高,差異具有統計學意義(P<0.05),見表1。

表1 各組小鼠行為學指標水平比較

2.2 各組小鼠炎癥指標水平比較

模型組、低劑量組、高劑量組小鼠IL-6、TNF-α水平明顯高于對照組,低劑量組和高劑量組小鼠IL-6、TNF-α水平明顯低于模型組,且隨劑量的增加而降低,差異具有統計學意義(P<0.05),見表2。

表2 各組小鼠炎癥指標水平比較

2.3 各組小鼠下丘腦-垂體-腎上腺皮質(HPA)軸相關激素水平比較

模型組、低劑量組、高劑量組小鼠CRF、ACTH、CORT水平明顯高于對照組,低劑量組和高劑量組小鼠CRF、ACTH、CORT水平明顯低于模型組,且隨劑量的增加而降低,差異具有統計學意義(P<0.05),見表3。

表3 各組小鼠HPA軸相關激素水平比較

2.4 各組小鼠GR結合力比較

模型組、低劑量組、高劑量組小鼠GR結合力明顯低于對照組,低劑量組和高劑量組小鼠GR結合力明顯高于模型組,且隨劑量的增加而升高,差異具有統計學意義(P<0.05),見表4。

表4 各組小鼠GR結合力比較

2.5 各組小鼠GR蛋白表達水平比較

模型組、低劑量組、高劑量組小鼠GR蛋白水平明顯低于對照組,低劑量組和高劑量組小鼠GR蛋白水平明顯高于模型組,且隨劑量的增加而升高,差異具有統計學意義(P<0.05),見圖1。

a：P<0.05,與對照組比較；b：P<0.05,與模型組比較；c：P<0.05,與低劑量組比較。

3 討 論

抑郁癥是由各種原因引起的以抑郁為主要癥狀的一組心境障礙或情感性障礙。WHO調查顯示,目前全球有四億人患有抑郁癥,心理疾病已成為全球第四大疾病[7]。目前治療抑郁癥的藥物較多,但仍有33%的患者抗抑郁治療效果較差,且部分抗抑郁藥物長期服用后的不良反應明顯,對患者身體傷害較大,因此尋找一種低毒、有效的抗抑郁藥成為目前抑郁癥相關研究的主要方向[8]。

中醫認為,腎虛肝郁是抑郁癥的主要證型之一[9]?，F代醫學認為,腎虛證涵蓋了神經-內分泌-免疫免疫網絡的紊亂,其中HPA軸及免疫功能紊亂是其主要體現。ZHOU等[10]研究表明,重度抑郁患者存在HPA軸及免疫功能紊亂,這與腎虛證存在相似的病理生理基礎。淫羊藿是中醫溫補腎陽的常見藥物,性溫,味辛甘,歸肝腎經,具有滋補肝腎、壯陽、祛風濕、改善免疫功能、鎮靜、抑制腸道病毒及強筋骨等功能。淫羊藿苷是由淫羊藿提取、分離、純化而來,屬于黃酮類,具有保護神經、成骨、抗癌、抗炎及抗氧化功能[11]。方麗媛等[12]研究表明,淫羊藿苷可通過提高乙酰膽堿酶和乙酰膽堿轉移酶活性降低氧化應激，減輕老年癡呆小鼠類老年癡呆病理癥狀,且存在一定的劑量依賴性。本實驗中,低劑量組、高劑量組小鼠水平穿越格數、社區區域停留時間及體重明顯高于模型組,且隨劑量的增加而升高。淫羊藿苷可明顯改善抑郁小鼠的社交活動,減輕小鼠抑郁狀態。

研究[13]認為,免疫系統的過度激活是抑郁癥發病的重要機制之一,其中IL-6及TNF-α等神經炎癥因子成為研究的重點。TNF-α是由單核巨噬細胞及神經細胞等釋放的一種炎癥因子。KURANOBU等[14]研究表明,新生幼鼠皮下注射TNF-α,成年后出現抑郁性癥狀的概率大大升高。IL-6由淋巴細胞及非淋巴細胞釋放,可介導炎性反應。本實驗中,低劑量組、高劑量組小鼠IL-6、TNF-α水平明顯低于模型組,且隨劑量的增加而降低。提示淫羊藿苷可通過降低抑郁小鼠炎性反應，改善抑郁癥狀,與ZHANG等[15]的研究結果相近。

抑郁癥患者糖皮質水平低下與慢性炎癥并存,GR下調是重要原因之一,MEGAN等[16]研究證明,GR與抑郁存在密切聯系,GR下調的轉基因小鼠應激后出現抑郁狀態的概率較高。HPA軸參與控制機體的應激反應,調節心情、情緒、性行為及免疫系統等心理身體活動,下丘腦分泌的CRH可刺激ACTH的分泌,同時ACTH可調控CORT的表達,而CORT則可反向控制CRH及ACTH的水平[17]。HPA軸是人類行為反應及適應壓力的中心。既往研究表明,抑郁癥的發生與HPA軸功能亢進存在密切聯系[18]。NORMANN等[19]研究表明。老年抑郁癥患者自殺發生率與HPA軸紊亂存在一定聯系,密切監測HPA軸的變化可明顯降低患者自殺率。本實驗中,低劑量組、高劑量組小鼠GR結合力及GR蛋白水平明顯高于模型組,且隨劑量的增加而升高。低劑量組、高劑量組小鼠CRF、ACTH、CORT水平明顯低于模型組,且隨劑量的增加而降低。提示淫羊藿苷良性調整抑郁小鼠社交行為及神經內分泌功能可能與淫羊藿苷通過調控GR蛋白水平調節CRF及HPA軸相關激素表達有關。

綜上所述,淫羊藿苷可良性調整抑郁小鼠社交行為及神經內分泌功能,降低小鼠慢性炎性反應,其機制可能與淫羊藿苷通過調控GR蛋白水平調節CRF及HPA軸相關激素表達有關。