深翻和秸稈還田對土壤微生物群落功能多樣性的影響

張乃文，韓曉增，樸勇杰，蔣 銳，嚴 君，陳 旭，陸欣春，鄒文秀，閆 雷

(1. 中國科學院東北地理與農業生態研究所，黑龍江 哈爾濱 150081；2. 東北農業大學資源與環境學院，黑龍江 哈爾濱 150030；3. 北大荒集團八五二分公司農業技術推廣中心，黑龍江 雙鴨山 155100)

土壤中存在著大量的微生物群體，在土壤生態系統的能量流動及養分循環中扮演著重要的角色[1]，更重要的是，土壤微生物是反映土壤微環境變化的敏感性指標，其群落組成以及多樣性對土壤生態系統的功能起著決定性作用[2]。土壤微生物群落功能多樣性是反映土壤中微生物生態特征的指標，對了解微生物多樣性提供可靠依據[3]。其中Biolog-Eco微平板法是根據土壤微生物對不同單一碳源利用能力的差異，表征土壤微生物代謝功能多樣性，Biolog法最初被應用于菌種鑒定，1991年Garland和Mills首次將該方法用于微生物群落特征的研究，近二十幾年來被廣泛應用于微生物功能多樣性的研究中[4]。這種方法具有操作簡單，靈敏度高及分辨力強等優點，可以最大限度保留微生物群落原有的代謝特征，對揭示土壤微生物結構和功能多樣性起著重要作用[5]。

土壤耕作方式的改變在影響土壤物理性質的同時，對土壤微生物群落也會產生影響。近年來，國內外學者利用土壤微生物來研究耕作方式對土壤生態系統的影響[6-7]。秸稈作為富含各種營養元素的農副產物，目前已被廣泛應用于農業可持續發展中，有研究表明，秸稈還田不僅可以為土壤提供營養元素從而改善土壤理化性質，還可以對土壤微生物的群落以及功能產生影響[8]。土壤深翻也被視作保護性耕作措施之一，可以改變土壤物理結構，降低土壤容重，增加土壤通透性，增加土壤微生物量以及酶活性[9-11]。目前也有很多學者開展了對秸稈還田的研究，但對于不同秸稈還田方式對微生物的影響研究不夠透徹，相對于傳統耕作，免耕秸稈還田通過較少擾動增加土壤微生物的生物量[12]，但也有研究發現，免耕秸稈還田僅能增加表層幾厘米處土壤養分含量以及各類群微生物數量及酶活性[13]，然而深翻還田能有效地打破犁底層，顯著影響土壤理化性質，如提高土壤全效、速效養分含量，進而間接影響微生物群落結構，并且秸稈的輸入使這種效果更加顯著[14-15]。但是，深翻和秸稈還田對土壤微生物群落代謝功能多樣性的影響缺少系統研究，并且其變化在不同土壤層次的差異尚不明確，同時關于秸稈深翻還田對土壤微生物群落代謝功能多樣性影響的綜合評價還鮮有報道。因此，本研究基于深翻和秸稈還田的田間對比試驗，探討其對不同土層土壤微生物群落功能多樣性的影響，以期為建立合理的秸稈還田模式提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗區概況與試驗設計

試驗始于2018年，在黑龍江省海倫市光榮村(47.21°N，126.50°E)進行，該地區屬于典型溫帶大陸性季風氣候，冬季寒冷干燥，夏季高溫多雨，雨熱同期，年平均氣溫1.5℃，年平均降水量約550 mm，降水主要集中在7—9月，無霜期約為125 d。土壤類型為中厚黑土。

試驗共設置4個處理：常規耕作(CT，耕作深度15 cm，無秸稈還田)、秸稈淺混(SCT，耕作深度15 cm)、深翻(ST，耕作深度35 cm，無秸稈還田)、秸稈深混(SST，耕作深度35 cm)。SCT和SST的秸稈還田量均為10 000 kg·hm-2，秸稈粉碎至小于5 cm，均勻混合于相應深度土層中。試驗采用完全隨機區組設計，4個重復，所有小區均采用人工翻耕。小區面積為12 m2(4 m× 3 m)，于每年5 月播種玉米。施肥量：氮肥(N)180.0 kg·hm-2、磷肥(P2O5)70.0 kg·hm-2和鉀肥(K2O)60.0 kg·hm-2。田間管理與當地相同。

1.2 樣品采集與處理

于2020年10月5日采集每個處理0～15 cm和15～35 cm土層土壤樣品，每個小區隨機采集3個點的土壤樣品，然后混合成一個樣品，裝在無菌袋中，迅速帶回實驗室。通過2 mm篩后放入4℃冰箱保存。

1.3 測定方法

1.3.1 土壤微生物功能多樣性測定 試驗采用Biolog-Eco微平板法測定，每個Biolog-Eco板上有96個小孔，設有3次重復，每個重復包含1個空白對照和31種單一碳源。利用烘干法測定土壤中含水率，通過含水率計算，稱取相當于10 g烘干土的鮮土于裝有90 ml滅菌的NaCl溶液(濃度為0.85%)中，210 r·min-1震蕩30 min后靜置20 min，然后取土壤上清液1 ml加入到9 ml NaCl溶液(0.85%)中，重復一次，最終制成稀釋1 000倍的土壤稀釋液；再用8通道加樣器向Biolog-Eco板(BIOLOG，美國)加入150 μL土壤稀釋液，于25℃下恒溫避光培養，每隔24 h用BiologReader(BIOLOG，美國)讀取590 nm和750 nm波長下吸光度數值，連續測定7 d[16]。

1.3.2 土壤理化指標測定 微生物量碳(MBC)和微生物量氮(MBN)采用氯仿熏蒸-K2SO4浸提法測定[17]。可溶性有機碳(DOC)用硫酸鉀溶液提取，采用TOC-VCPH+TNM-1 總有機碳分析儀(SHIMADZU，日本)[18]測定。

1.4 數據分析

按照AIMEE等[19]方法計算：

平均顏色變化率(AWCD)：

AWCD=∑(Ci-R)/31

(1)

Shannon多樣性指數(H)：

H=-∑Piln(Pi)

(2)

Simpson優勢度指數(D)：

D=1-∑(Pi)2

(3)

Mclntosh均勻度指數(U)：

(4)

式中,Ci為各反應孔在590 nm的吸光值；R為Biolog-Eco板對照孔的吸光值；Ci-R<0.06時在計算中記為零；Pi為第i孔的相對吸光值與平板所有反應孔相對吸光值總和的比率；Ni為第i孔的相對吸光值。

使用Excel 2017整理試驗數據，SPSS Statistics 22進行方差分析，采用Canoco 5.0軟件進行主成分分析(Principal component analysis,PCA)，對微生物群落結構變化與環境因子構建結構方程模型(SEM)，SEM模型的構建和計算使用軟件Amos v.24進行。采用Origin 2018作圖。

2 結果與分析

2.1 深翻和秸稈還田對土壤微生物群落單孔平均顏色變化率的影響

連續7 d每隔24 h測得AWCD值見圖1，不同處理AWCD隨時間的延長而增加，土壤微生物在培養24 h內無顯著代謝增長。從24 h到培養結束，所有處理下微生物的碳源代謝能力一直在增強，且在24～72 h內呈急速上升的趨勢。在CT和SCT處理下土壤微生物碳源代謝利用能力在0～15 cm土層明顯高于15～35 cm土層。總體上0～15 cm土層AWCD值表現為SCT>SST>CT>ST，而15～35 cm土層AWCD值表現為SST>ST>SCT>CT。

圖1 土壤微生物群落平均顏色變化率(AWCD)隨時間的變化

2.2 深翻和秸稈還田對土壤微生物群落功能多樣性指數的影響

Shannon多樣性指數(H)、Simpson優勢度指數(D)和Mclntosh均勻度指數(U)等可以反映土壤微生物群落功能多樣性。選取培養72 h進行土壤微生物群落功能多樣性分析。從表1可以看出，不同處理Shannon指數和Simpson指數在0～15 cm和15～35 cm土層的差異不顯著，在CT和SCT處理下Mclntosh指數在0～15 cm高于15～35 cm土層。其中0～15 cm土層Mclntosh指數表現為SCT>SST>CT>ST，且處理間差異顯著。

表1 土壤微生物群落功能多樣性指數

2.3 深翻和秸稈還田對土壤微生物碳源利用的影響

Biolog-Eco板上含有的31種碳源可以根據其化學基團的性質不同分為6大類。選取培養72 h進行碳源利用率分析。從圖2中可以看出，在所有處理下土壤微生物對糖類、氨基酸類、多聚物類和羧酸類碳源的利用率均明顯高于胺類和酚酸類，其中微生物群落利用的最高碳源為糖類，其次為氨基酸類。在0～15 cm土層中，SCT處理土壤微生物對糖類碳源的利用率最高，SST處理土壤微生物對氨基酸類碳源的利用率最高，ST處理土壤微生物對多聚物類和胺類碳源的利用率最高，CT處理土壤微生物對羧酸類碳源的利用率最高。在15～35 cm土層中，SCT處理土壤微生物對糖類、胺類和酚酸類，CT處理土壤微生物對氨基酸、多聚物類和羧酸類碳源的利用率最高。

注：1:糖類;2:氨基酸類;3:多聚物類;4:羧酸類;5:胺類;6:酚酸。

2.4 深翻和秸稈還田對土壤微生物群落碳源利用多樣性的影響

對培養72 h的土壤微生物AWCD值進行主成分分析，結果見圖3。選取前兩個主成分，其貢獻率分別為：33.37%和18.85%，累計貢獻率為52.22%。從樣品點的分布來看深翻和秸稈還田對土壤微生物群落碳源利用方式產生了顯著影響，其中主要表現在秸稈的施用。在PCA1方向，0～15 cm土層的SCT和SST處理以及15～35 cm土層的SST處理與其他處理差異顯著，這3種處理位于PCA1正端，而其他處理位于負端，且之間差異較小。在PCA2方向，0～15 cm和15～35 cm土層中SST和ST處理位于PCA2正端，0～15 cm土層的CT處理以及15～35 cm土層的CT和SCT處理位于PCA2負端，0～15 cm土層的SCT處理在正端和負端均有分布。

圖3 深翻和秸稈還田下土壤微生物碳源利用的主成分分析

與PCA1 和PCA2 相關的31 種碳源信息見表2，其中與PCA1 貢獻較大的碳源有糖類：D-葡萄胺酸、D-甘露醇、D-半乳糖醛酸、D-木糖、D-半乳糖內酯；氨基酸類：L-絲氨酸、L-精氨酸、L-苯基丙氨酸；羧酸類：丙酮酸甲脂；胺類：苯乙基胺。與PCA2 顯著相關的碳源有糖類：N-乙酰基-D-葡糖胺；羧酸類：D-蘋果酸。這些碳源因子使不同處理的土壤微生物群落功能多樣性存在差異。

表2 31類碳源主成分矩陣

2.5 深翻和秸稈還田對土壤微生物群落功能特征變化的主要影響因子

對不同處理土壤理化因子(DOC、MBC和MBN)進行分析，結果見表3。同一土層各處理土壤之間存在顯著差異。在0～15 cm土層，與CT相比，SCT和SST處理顯著增加了土壤DOC、MBC和MBN含量。在15～35 cm土層，土壤DOC、MBC和MBN含量的變化趨勢為SST>ST>SCT>CT，其中SCT和CT處理之間差異不顯著；與CT相比，DOC、MBC和MBN含量在SST處理下分別顯著增加了17.25%、50.00%和168.10%。

表3 深翻和秸稈還田下土壤的可溶性有機碳和微生物量碳氮/(mg·kg-1)

本研究采用SEM模型進一步揭示深翻和秸稈還田驅動土壤微生物群落功能多樣性指數變化的直接或間接途徑(圖4)。SEM模型顯示，深翻可以直接作用于Shannon指數、Simpson指數和Mclntosh指數，對土壤微生物群落功能多樣性產生影響，深翻也可以通過改變土壤DOC含量間接影響土壤微生物群落Mclntosh指數。秸稈還田則是通過改變土壤化學性質間接影響土壤微生物群落功能多樣性指數，并且秸稈還田對Mclntosh指數的變化產生了顯著影響(標準化總效應為0.980)。

注：實箭頭和虛線箭頭分別表示正相關和負相關(P<0.05)。***表示P<0.001,**表示P<0.01,*表示P<0.05。箭頭上的數字表示重要的標準化路徑系數。χ2表示卡方擬合指數，R2表示模型解釋的因變量方差。H：Shannon多樣性指數；D：Simpson優勢度指數；U：Mclntosh均勻度指數。

3 討 論

大量研究證明深翻和秸稈還田會影響土壤微生物的群落結構及功能[20-21]。張常仁等[13]在研究中發現，秸稈還田能明顯提高土壤磷脂脂肪酸、細菌、真菌和放線菌微生物生物量，提高土壤微生物多樣性。與免耕相比，翻耕也可以提高土壤中各類群微生物數量與總微生物數量[22]。本研究采用Biolog-Eco生態板技術對深翻和秸稈還田下的微生物代謝活性進行分析，發現與常規耕作相比，秸稈淺混和秸稈深混處理顯著提高0～15 cm土層的AWCD值，這與顧美英等[23]和孟超然等[24]的研究結果一致，其原因可能是秸稈混入土壤后，顯著提高了土壤中N、P、K等養分和有機質含量，為微生物提供了充足的碳源和氮源，促進微生物生長和繁殖，同時也增強了土壤微生物群落利用碳源的能力，提高土壤微生物活性[25-26]。由于土壤的長期不合理耕作，如機械碾壓等，導致了犁底層的存在[27]，限制了土壤中的水熱傳導和微生物活動。與常規耕作相比，深翻處理的土壤微生物AWCD值在15～35 cm土層顯著提高，其原因可能是深翻打破了犁底層，改善了土壤結構，影響土壤養分積累，為微生物的生長繁殖提供了較適宜的土壤環境[28-29]。本研究還發現，在0～15 cm土層秸稈還田處理對AWCD的影響表現為秸稈淺混>秸稈深混，這是因為等量秸稈換入不同深度土層，而致使在同一土層秸稈的含量不同[14]。這與周東興等[30]對不同秸稈還田量對微生物群落功能多樣性影響的研究結果一致，大量的秸稈施入土壤，改善土壤理化性質及結構，從而促進土壤微生物的代謝活動[31]，但秸稈還田量過高和過低，也會影響秸稈降解微生物群落碳源代謝活性，對其產生不利影響。

通過對不同耕作措施下碳源代謝的多樣性指數分析可以較準確地反映出土壤微生物群落功能多樣性的變化[32]，雖然本研究中深翻及秸稈還田沒有對Shannon指數和Simpson指數產生顯著影響，但是與常規耕作相比，秸稈還田顯著提高了Mclntosh指數。Li等[33]研究表明作物秸稈還田對Shannon指數、Simpson指數和Mclntosh指數等微生物功能多樣性指數和碳源利用強度沒有顯著影響，羅希茜等[34]關于長期不同施肥對稻田土壤微生物群落功能多樣性影響的研究中也有類似結果。關于Mclntosh指數，本研究與前人研究結果不一致，其原因可能是本研究秸稈還田的時間較短，并沒有對土壤環境產生較大影響，而羅希茜等人是對長期秸稈還田下土壤進行分析；其次可能是因為本研究土壤的有機質含量較高，肥力較強[35]。另外，本研究發現深翻處理降低了0～15 cm土層的Mclntosh指數，可能是由于深翻過程中是亞耕層土壤與表層土壤充分混合的過程，導致深翻后 0～15 cm 土層土壤肥力減低限制了其他種微生物種群的生長代謝，致使群落均勻度下降[36]。

不同耕作措施下土壤微生物對單一碳源的相對利用程度存在相似性和差異性。本研究中土壤微生物代謝的最主要碳源是糖類、氨基酸類、多聚物類以及羧酸類，高晶晶等[37]對不同耕作措施下土壤微生物代謝特征的研究發現，秸稈深混處理下糖類、氨基酸類和羧酸類的利用率較高，本研究與其研究結果中可培養的優勢菌群是一致的，劉晶鑫等[38]研究也有相同的結論。不同處理下微生物對6種碳源的利用率在0～15 cm和15～35 cm兩個土層之間的差異不顯著，而在不同處理間的差異顯著。對31種碳源利用情況的主成分分析也顯示，土壤微生物代謝功能在秸稈還田處理和未秸稈還田處理之間存在差異。這可能是因為秸稈的加入使土壤有機質含量和組份發生改變，韓曉增等[35]研究表明，秸稈還田在改善土壤物理結構的同時，也可以使土壤有機質含量和速效養分含量增加，本研究中秸稈處理下DOC、MBC和MBN含量增加也證明如此。也有研究[8，39]證明土壤微生物生物量、群落組成及其活性與土壤有機質含量及組成的關系密切相關，區余瑞等[40]研究發現微生物群落功能多樣性與土壤有機碳及全氮含量相關。本研究發現，與常規處理相比，秸稈深混顯著增加了土壤中DOC、MBC和MBN含量，MBC和MBN是固定在土壤微生物殘體中的碳素和氮素，是植物生長可利用養分的重要來源，其含量的多少取決于土壤中微生物的含量[41]。卜洪震等[42]研究表明秸稈還田顯著提高土壤中MBC含量，促使微生物活性增加，進一步影響微生物群落組成。SEM模型顯示，DOC是調控土壤微生物群落結構和豐富度的變異首要因素，并且深翻和秸稈還田更多直接作用于微生物群落功能多樣性指數，并非通過MBC及MBN等間接調節。

4 結 論

基于深翻和秸稈還田的田間試驗研究發現，深翻和秸稈還田耕作下土壤微生物碳源利用率最高為糖類，其次為氨基酸類、多聚物類以及羧酸類。深翻提高了0～15 cm土層土壤微生物群落代謝功能的均勻度指數，且土壤微生物群落代謝功能多樣性在有秸稈還田和未秸稈還田之間存在顯著差異，可見秸稈還田會對土壤微生物群落功能的改善產生一定影響。另外，深翻和秸稈還田可以通過土壤養分的變化進而影響土壤微生物群落功能多樣性。因此，本試驗可為明確深翻及秸稈還田對不同土層土壤微生物群落功能多樣性的影響以及提高土壤活力提供一定的理論依據。