綠肥和施氮對旱作冬小麥農(nóng)田土壤酶活性的影響

馮曉玲，王 俊，2，高 媛，溫萌萌，豆 瑩，方震文

(1.西北大學(xué)城市與環(huán)境學(xué)院，陜西 西安 710127; 2.陜西省地表系統(tǒng)與環(huán)境承載力重點實驗室，陜西 西安 710127)

“藏糧于地、藏糧于技”是我國當下農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的重大戰(zhàn)略需求，如何尋求一種可持續(xù)的管理方式，在保障糧食安全的同時全面提升土壤質(zhì)量是一個亟待解決的學(xué)術(shù)命題。在主要糧食作物生長休閑期間，引種豆科或非豆科綠肥填閑作物具有促進土壤碳氮固存[1]、改善土壤結(jié)構(gòu)、促進微生物代謝、減少養(yǎng)分淋溶和抑制雜草病蟲害[2]等多種生態(tài)環(huán)境效益，此種植技術(shù)近年來在世界范圍內(nèi)得到大面積推廣應(yīng)用。

土壤中各種生物化學(xué)反應(yīng)過程都有酶的參與[3]。土壤酶對于外部變化引起的反應(yīng)是快速且敏感的，酶活性的大小可以反映其控制的酶促反應(yīng)的方向和強度[4]。一方面，研究酶活性可以比較不同農(nóng)田管理措施下土壤環(huán)境特征變化，另一方面，它可以反映土壤碳、氮元素的轉(zhuǎn)化，進而評價土壤養(yǎng)分的轉(zhuǎn)化。孫穎[5]、彭映平[6]等研究發(fā)現(xiàn)，在黃土高原地區(qū)種植豆科綠肥能顯著提高土壤蔗糖酶、脲酶、磷酸酶、芳基硫酸酯酶和脫氫酶活性，其原因主要在于綠肥翻壓后增強了土壤有機質(zhì)、氮素等養(yǎng)分含量，提高了土壤微生物的活性，改善了土壤性狀所致。與豆科綠肥相比，非豆科綠肥通常具有更大的生物量積累，因而翻壓入土后能夠增加底物供給，促進土壤碳、氮固定[7-8]。然而就目前研究來看，針對豆科綠肥、非豆科綠肥及豆科和非豆科混播綠肥對土壤酶活性的報道尚不多見。

本文基于田間定位試驗, 比較了種植豆科和非豆科綠肥對土壤酶活性的影響差異，并重點關(guān)注與土壤碳、氮循環(huán)相關(guān)的β-葡萄糖苷酶、纖維二糖水解酶、乙酰氨基葡萄糖苷酶和亮氨酸氨基肽酶活性變化，旨在進一步探討綠肥種植系統(tǒng)土壤肥力提升機制，并為其在黃土高原旱作農(nóng)業(yè)區(qū)的推廣應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

田間試驗在陜西省長武縣黃土高原農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)國家野外科學(xué)觀測研究站(107°44′E，35°12′N) 進行。該站地處黃土高原中南部，海拔1 220 m，屬暖溫帶半干旱半濕潤大陸性季風(fēng)氣候，年均氣溫9.1℃，無霜期約171 d，年均蒸發(fā)量1 440 mm，年均降水量為580 mm，且季節(jié)性分布不均，多集中于夏秋季節(jié)。試驗地土壤為黑壚土，供試土壤基本理化性質(zhì)如下：有機質(zhì)12.0 g·kg-1，全氮0.8 g·kg-1，全磷0.66 g·kg-1，礦質(zhì)氮13.74 g·kg-1，速效磷24.6 mg·kg-1、速效鉀161.39 g·kg-1，pH 8.11。該研究區(qū)屬于典型旱作農(nóng)業(yè)區(qū)，種植制度為一年一熟或兩年三熟。

1.2 試驗設(shè)計

試驗自2017年7月初前季小麥收獲后開始，采取綠肥作物和施氮水平雙因素完全隨機區(qū)組設(shè)計，其中綠肥作物在前季冬小麥收獲后的夏季休閑期種植，包括長武懷豆單播(SB)、蘇丹草單播(SG)、長武懷豆+蘇丹草混播(MIX)和裸地休閑(CK)，氮肥在冬小麥播前施入，包括0、60、120 kg·hm-2共3個水平。總計12個處理，每處理重復(fù)3次，共36個小區(qū)，隨機區(qū)組排列。小區(qū)面積6.7 m×10 m，小區(qū)間留有保護行，寬度1 m。

綠肥作物每年6月底至7月初冬小麥收獲后播種，其中SB處理長武懷豆播量為70 kg·hm-2，SG處理蘇丹草播量為35 kg·hm-2, MIX處理中懷豆和蘇丹草播量分別為35 kg·hm-2和17.5 kg·hm-2。綠肥作物于每年9月中旬使用旋耕機將地上部分全部直接翻壓入土，翻壓深度為20 cm，兩周后播種冬小麥，播量為165 kg·hm-2。小麥播種時按氮肥水平設(shè)計分別施入尿素(46%)，同時各小區(qū)按60 kg·hm-2施入過磷酸鈣作為基肥。

2021年6月在小麥收獲后按五點采樣法采集表層(0～10 cm和10～20 cm)土樣，充分混合，去除植物殘根等雜物，過2 mm篩后裝入自封袋中，放置在裝有冰袋的保溫箱帶回實驗室。

1.3 指標測定

采用96孔微孔板熒光法[9]測定了4種水解酶活性，分別為β-葡萄糖苷酶(β-1,4-glucosidase)、纖維二糖水解酶(Cellobiohydrolase)、乙酰氨基葡萄糖苷酶(β-1,4-N-acetylglucosaminidase)和亮氨酸氨基肽酶(Leucine aminopeptidase)。測定時所用的底物分別是是4-甲基傘形酮-β-D-吡喃葡糖苷、4-甲基傘形酮-β-D-纖維素二糖苷、4-甲基傘形花序基N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷、L-亮氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素鹽酸鹽。另外，β-葡萄糖苷酶、纖維二糖水解酶、乙酰氨基葡萄糖苷酶所用的標準物質(zhì)均為4-甲基傘形酮，亮氨酸氨基肽酶所用的標準物質(zhì)為7-氨基-4-甲基香豆素。

具體測定步驟如下：稱取1 g鮮土放入250 mL的塑料瓶，添加125 mL去離子水并搖晃60 s，制成懸濁液, 取200 μL懸濁液加入到96孔微孔板中, 每個樣品有3個重復(fù)(200 μL樣品懸濁液+ 50 μL酶底物), 3個陰性對照(200 μL去離子水+ 50 μL酶底物)和3個空白(200 μL樣品懸濁液+ 50 μL去離子水)作為對照, 再加以3個淬火標準(200 μL樣品懸濁液+ 50 μL標準液)及參考標準(200 μL去離子水+ 50 μL標準液)進行校正。微孔板在25℃黑暗條件下培養(yǎng)4 h，加入10 μL 0.5 mol·L-1的NaOH溶液使其停止反應(yīng)。用Synergy H4多功能酶標儀(Molecular Devices, SanJose, USA)測定熒光值, 熒光激發(fā)光和檢測光波長分別在365 nm和450 nm處。

土壤酶活性計算公式為[9]:

Ab=F×V/(eV1t×m)

(1)

F=(f-fb)/q-fs

(2)

e=fr/(csV2)

(3)

q=(fq-fb)/fr

(4)

式中，Ab表示土壤樣品的水解酶活性，F(xiàn)表示樣品的熒光值，V表示土壤懸濁液的體積(125 ml)，V1表示微孔中的土壤懸濁液的體積(200 μl)，t表示暗培養(yǎng)的時間(4 h)，m表示風(fēng)干土壤的質(zhì)量。f表示樣品微孔的熒光值，fb表示空白微孔的熒光值，fs表示陰性對照的熒光值，fr表示參考標準微孔的熒光值，fq表示淬火標準的熒光值。e表示熒光釋放系數(shù)，q表示淬火系數(shù)，cs表示參考標準微孔中的濃度(10 μmol·L-1)，V2表示加入的標準物質(zhì)的體積(50 μl)。酶活性以每小時每克干物質(zhì)消耗底物的摩爾數(shù)(nmol·g-1·h-1)來表示[14]。

總體酶活性指數(shù)(Total enzyme activity index， TEI)計算公式[10]為：

(5)

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)使用SPSS 25.0軟件進行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 綠肥和施氮對β-葡萄糖苷酶活性的影響

綠肥種植和施氮對土壤β-葡萄糖苷酶活性均具有極顯著的影響，但二者沒有交互作用(表1)。與CK相比，SB、SG、MIX處理β-葡萄糖苷酶活性在0～10 cm土層分別提高了59.2%、41.2%和29.4% (P<0.05)，在10～20 cm土層分別提高了36.5%、41.8%和21.4%(P<0.05)，不同綠肥處理間差異不顯著(圖1A)。隨著施氮量增加，土壤β-葡萄糖苷酶活性呈增加趨勢(圖1B)，其中施氮水平120 kg·hm-2顯著高于不施氮和施氮60 kg·hm-2，相較于不施氮肥，施氮60 kg·hm-2和120 kg·hm-2處理在0～10 cm土層分別提高土壤β-葡萄糖苷酶活性17.1%和46.6%，在10～20 cm土層分別增加了17.8%和69.4%。

圖1 綠肥(A)和施氮(B)對β-葡萄糖苷酶活性的影響

2.2 綠肥和施氮對纖維二糖水解酶活性的影響

由表1可以看出，綠肥和施氮對纖維二糖水解酶活性均具有極顯著影響，且二者在0～10 cm土層存在顯著交互作用。與CK相比，SB、SG、MIX處理土壤纖維二糖水解酶活性在0～10 cm土層分別增加了30.0%、25.9%和24.2%(P<0.05)，在10～20 cm土層分別增加了13.2%、15.6%和6.19%(P<0.05)，且綠肥作物間差異不顯著(圖2A)。土壤纖維二糖水解酶活性同樣隨著施氮量的增加而增加(圖2B)。在不施氮情況下，0～10 cm土層纖維二糖水解酶活性綠肥處理間差異不顯著；而施氮后， SB處理土壤纖維二糖水解酶活性顯著高于SG和MIX處理(圖3)。

圖3 0～10 cm土層綠肥與施氮交互作用對土壤纖維二糖水解酶活性的影響

2.3 綠肥和施氮對乙酰氨基葡萄糖苷酶活性的影響

綠肥和施氮均對土壤乙酰氨基葡萄糖苷酶酶活性有顯著影響，但二者交互作用不顯著(表1)。與CK相比，SB、SG、MIX處理土壤乙酰氨基葡萄糖苷酶酶活性在0～10 cm土層平均分別增加了40.5%、28.5%和27.2%(P<0.05)，在10～20 cm土層分別增加了48.2%、32.9%和42.5%，且SB處理與SG和MIX處理之間差異顯著(圖4A)。隨著施氮量增加，土壤乙酰氨基葡萄糖苷酶酶活性呈增加趨勢(圖4B)，其中施氮水平120 kg·hm-2的值顯著高于不施氮和施氮60 kg·hm-2的值。

圖4 綠肥(A)和施氮(B)對乙酰氨基葡萄糖苷酶活性的影響

2.4 綠肥和施氮對亮氨酸氨基肽酶活性的影響

綠肥和施氮均對土壤亮氨酸氨基肽酶活性存在顯著影響，但兩者并無交互作用(表1)。由圖5A可見，在不同的綠肥種植下表現(xiàn)為SB>SG>MIX>CK, SB、SG和MIX處理土壤亮氨酸氨基肽酶活性在0～10 cm土層相比于CK分別平均提高了35.8%、24.7%和12.9 %(P<0.05)，在10～20 cm土層分別增加了30.6%、18.5%和22%(P<0.05)，且SB與SG處理和MIX處理間差異顯著(圖5A)。土壤亮氨酸氨基肽酶活性同樣隨著施氮量的增加而增加(圖5B)。相較于不施氮肥，施氮60 kg·hm-2和120 kg·hm-2處理在0～10 cm土層分別提高土壤亮氨酸氨基肽酶活性47.4%和108%，在10～20 cm土層分別增加了45.4%和93.6%。

圖5 綠肥(A)和施氮(B)對乙酰氨基葡萄糖苷酶活性的影響

2.5 綠肥和施氮對總體酶活性的影響

綠肥和施氮均對總體酶活性有顯著影響，但兩者并無交互作用(表1)。由圖6A可見，在不同的綠肥種植下，總體酶活性表現(xiàn)為SB>SG>MIX>CK, 相比于CK，SB、SG和MIX處理土壤總體酶活性在0～10 cm土層平均分別提高了35.9%、21.4%和20.9%(P<0.05)，在10～20 cm土層中分別增加了23.5%、15.8%和13.2%(P<0.05)。與不施氮相比，施氮60 kg·hm-2和120 kg·hm-2均導(dǎo)致土壤總體酶活性顯著增加，且二者差異顯著(圖6B)。

圖6 綠肥(A)和施氮(B)對總體酶活性的影響

3 討 論

土壤酶活性可反映土壤養(yǎng)分轉(zhuǎn)化的動態(tài)過程[11]。土壤β-葡萄糖苷酶和纖維二糖水解酶均參與土壤有機質(zhì)礦化分解過程[12]，其中纖維二糖水解酶參與將纖維素水解為纖維二糖的過程[13]，而β-葡萄糖苷酶則將較為簡單的多糖水解為葡萄糖單糖[14]。本研究中種植綠肥后這兩種土壤酶活性均有顯著提高，與前人研究結(jié)果一致[15]。綠肥翻壓增加了土壤有機質(zhì)輸入，提高了微生物代謝底物供給水平，進而提高了土壤酶活性[16]。本研究中，懷豆當年地上生物量積累(3 754 kg·hm-2)顯著低于蘇丹草(5 040 kg·hm-2)和混播(4 953 kg·hm-2)，但綠肥種類對β-葡萄糖苷酶和纖維二糖水解酶活性的影響并無顯著差異，這可能是因為綠肥翻壓增加的底物輸入已經(jīng)滿足了微生物代謝所需碳源，當?shù)孜锕┙o水平到達一定程度時，酶活性并不會再提高[17]。

乙酰氨基葡萄糖苷酶和亮氨酸氨基肽酶與土壤氮素循環(huán)有關(guān)[18]，其中乙酰氨基葡萄糖苷酶主要催化幾丁質(zhì)水解的末端反應(yīng)，在甲殼質(zhì)和其他葡萄糖胺聚合物的降解中起著關(guān)鍵作用，而亮氨酸氨基肽酶主要作用于位于多肽末端的亮氨酸和其他疏水氨基酸的水解[18]。與上述兩種碳循環(huán)相關(guān)的酶活性不同，懷豆處理土壤乙酰氨基葡萄糖苷酶和亮氨酸氨基肽酶活性顯著高于蘇丹草和混播處理。盡管懷豆具有更低的生物量積累，但能通過生物固氮作用增加氮水平，同時其較低的碳氮比，導(dǎo)致殘余分解后會有更多的氮釋放，從而促進了這兩種氮循環(huán)相關(guān)的酶活性[19]。

本研究中，土壤β-葡萄糖苷酶、纖維二糖水解酶、乙酰氨基葡萄糖苷酶和亮氨酸氨基肽酶均隨施氮量的增加而增加，這證明氮素對酶活性的促進作用，這與之前的研究結(jié)果一致[20]，這可能是隨著施氮量的增加，作物根系分泌物增加和土壤微生物數(shù)量增加，微生物通過同化利用這些施入的氮素來促進自身的生長，提高土壤微生物生物量水平，激發(fā)土壤有關(guān)微生物分泌酶，進而導(dǎo)致酶活性顯著增加[21],但當施氮量超過一定閾值，過高的氮肥用量會導(dǎo)致酶活性的減弱[22-24]。在陜西長武田間試驗中，彭映平等[6]研究發(fā)現(xiàn)，當施氮量為135 kg·hm-2時對土壤酶活性的影響最大，而當施氮量達到162 kg·hm-2時，土壤酶活性受到抑制。本研究中，氮肥施用量在 0～120 kg·hm-2范圍內(nèi)均有宜于提高土壤水解酶活性。

綠肥和施氮對纖維二糖水解酶活性的影響具有顯著交互作用，但對其它三種酶活性并無交互影響。孫穎等[5]在陜西長武的試驗發(fā)現(xiàn)，綠肥與氮肥對蔗糖酶、磷酸酶、芳基硫酸酯酶和脫氫酶活性具有顯著的交互影響，但對脲酶活性無顯著作用。而楊濱娟等[25]研究發(fā)現(xiàn)，施氮和綠肥的交互作用對過氧化氫酶和脲酶活性并不顯著，更多地影響了轉(zhuǎn)化酶活性。綜上所述，綠肥和氮肥對土壤酶活性具有不同的影響機制，而添加氮肥會刺激綠肥殘余的分解過程，其內(nèi)在機理尚待進一步探索。

4 結(jié) 論

在黃土高原旱作農(nóng)業(yè)區(qū)，冬小麥生長夏閑期種植長武懷豆、蘇丹草或二者混播均能通過增加額外的有機輸入刺激土壤酶活性的提高。綠肥種類差異并未顯著影響土壤碳循環(huán)相關(guān)的β-葡萄糖苷酶和纖維二糖水解酶活性，但與非豆科綠肥或混播相比，種植豆科綠肥能通過改善土壤供氮水平而提高氮循環(huán)相關(guān)的乙酰氨基葡萄糖苷酶和亮氨酸氨基肽酶活性約12.9%～48.2%。增施氮肥能顯著提高土壤酶活性，且隨施氮量的增加土壤酶活性也顯著提高，與不施氮肥相比，施氮60 kg·hm-2和120 kg·hm-2處理不僅可以提高土壤碳循環(huán)相關(guān)酶活性約17.1%～69.6%，還可以提高氮相關(guān)酶活性約19.1%～108%。綜合來看，針對旱地冬小麥單作系統(tǒng)，夏閑期種植綠肥作物尤其是豆科綠肥作物結(jié)合后期增施氮肥能夠增強土壤酶活性，進而提高土壤質(zhì)量。