羊毛中驅(qū)蚊酯長效驅(qū)避劑檢測方法建立及其緩釋性能研究

趙 聰，岳治光，寧曉冬，黃斌斌，陳 倩，張素梅，菅復(fù)春，張龍現(xiàn)，王榮軍，寧長申*

（1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450002；2.河南安進生物技術(shù)股份有限公司，河南 鄭州 450011；3.河南應(yīng)用技術(shù)職業(yè)學(xué)院，河南 鄭州 450042）

目前，生產(chǎn)中主要采用殺滅性的藥物來應(yīng)對蜱害，手段主要包括環(huán)境噴灑殺蟲劑、藥浴、口服或注射驅(qū)蟲藥等，這類方法雖可以有效殺滅硬蜱，但無法避免硬蜱對家畜的叮咬。而且殺滅性藥物的使用可能會帶來動物產(chǎn)品藥物殘留、環(huán)境污染以及硬蜱耐藥性等問題，不利于硬蜱防控工作的進行。而驅(qū)避劑則可以避免這類問題，其作用機制主要是通過發(fā)出氣味使硬蜱忌避、逃跑，進而達到防止硬蜱叮咬家畜的目的。驅(qū)蚊酯（IR3535）是一種廣譜、高效的昆蟲驅(qū)避劑［1-2］，噴灑在家畜體表可以有效減少放牧?xí)r來自硬蜱的侵害，但驅(qū)蚊酯噴灑在家畜體表后的有效成分往往流失較快，達不到持久的驅(qū)避效果［2-7］，因此，如何增強驅(qū)避劑的緩釋效果，延緩有效成分的釋放是驅(qū)避劑研制的重點［8］。

由于牛羊等放牧家畜體表覆有被毛，對其噴灑驅(qū)避劑后，驅(qū)避成分多附著于毛發(fā)上，因此，可以將家畜的毛發(fā)作為驅(qū)避劑緩釋性能研究的載體，使用驅(qū)蚊酯處理羊毛，并在不同時間點測定羊毛中的驅(qū)蚊酯含量，進一步研究驅(qū)蚊酯制劑的緩釋性能。考慮到采用噴灑的方式可能會造成驅(qū)避劑在毛發(fā)上分布不均勻，干擾動物毛發(fā)中驅(qū)蚊酯的定量分析，為此，本研究通過浸泡的方式處理羊毛樣品，取出干燥后于不同時間點測定其中驅(qū)蚊酯含量，并建立了一種羊毛中驅(qū)蚊酯含量的檢測方法，進而研究了不同配方驅(qū)蚊酯驅(qū)避劑的緩釋性能，以期篩選出一種驅(qū)蚊酯長效驅(qū)避劑。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 儀器 JEA302電子天平（上海蒲春計量儀器有限公司）；KQ-100B超聲波清洗機（上海合金超聲設(shè)備有限公司）；GC-2011氣相色譜儀（上海宜逸醇科學(xué)儀器有限公司）；AuW120D分析天平（日本SHIMADZU儀器有限公司）。

1.1.2 試劑 驅(qū)蚊酯原料（98%）購自廣州花之王化工有限公司；驅(qū)蚊酯標(biāo)準(zhǔn)品（97.7%）購自世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司；鄰苯二甲酸二甲酯（99.7%）購自美國CATO RESERCH CHEMICALS INC；95%乙醇、無水乙醇、丙酮、乳化劑0P-10均為分析純。

1.1.3 供試藥物 由4種緩釋物質(zhì)（聚乙二醇- 400、聚乙烯吡咯烷酮、α-吡咯烷酮、丙三醇）按不同比例配制而成的A、B、C、D 4種1%驅(qū)蚊酯長效驅(qū)避劑；1%驅(qū)蚊酯水溶液。以上供試藥物由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)寄生蟲學(xué)實驗室與河南安進生物技術(shù)股份有限公司聯(lián)合研制。

1.1.4 供試羊毛 采自陜西省麟游縣某波爾山羊種羊場的成年波爾山羊。沿山羊脊背部用剪刀剪取長度大于5 cm的羊毛約30 g，裝入自封袋中，置冰盒中帶回實驗室，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗方法

1.2.1 羊毛預(yù)處理 將羊毛分別放入去離子水、95%乙醇中，超聲清洗2次，每次10 min，以洗去羊毛表面的水溶性、脂溶性雜物；將羊毛在室內(nèi)靜置晾干，然后剪成長度為3 cm的小段，分成15份，每份精確稱取0.1 g，分別放在10 cm×10 cm稱量紙上，折疊包封后用訂書釘固定四角，用6號針頭在包封袋上按3×3共打9個孔，室溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 氣相色譜條件及參數(shù) 氣相色譜法色譜柱為SE-54毛細管柱；進樣口溫度230 ℃；檢測器溫度250 ℃；柱室溫度230 ℃；流量2.4 mL/min；分流比50∶1；載氣流量300 mL/min；氫氣流量20 mL/min；載氣為氮氣；進樣量2 μL［9］。

1.2.3 試驗條件的優(yōu)化篩選 影響驅(qū)蚊酯測定時峰面積的主要因素包括：羊毛浸泡的配方濃度、羊毛質(zhì)量、萃取溫度、萃取時間、萃取液體積、浸泡時間6個因素，除去羊毛浸泡的驅(qū)避劑濃度（1%）及羊毛質(zhì)量（0.1 g）為固定值外，對其他4個影響因素設(shè)計了4個單因素試驗來確定最佳試驗條件，每個單因素試驗處理組設(shè)置3個重復(fù)（萃取溫度、萃取時間、萃取液體積、浸泡時間的初始值分別為35℃、10 min、10 mL、10 min）。

1.2.3.1 萃取溫度對驅(qū)蚊酯峰面積影響的測定 將預(yù)處理的15份羊毛分為5組，每組3個重復(fù)，在濃度為1%驅(qū)蚊酯溶液中浸泡后取出，晾干羊毛后放入裝有10 mL無水乙醇的試管內(nèi)浸泡10 min，然后分別于20、25、30、35、40 ℃的條件下密封萃取15 min，吸取萃取液，使用氣相色譜儀進樣，測取峰面積。

1.2.3.2 萃取時間對驅(qū)蚊酯峰面積影響的測定 將預(yù)處理的15份羊毛分為5組，每組3個重復(fù)，在濃度為1%的驅(qū)蚊酯溶液中浸泡后取出，晾干后放入裝有10 mL無水乙醇的試管內(nèi)浸泡10 min，然后在35 ℃密封條件下分別萃取5、10、15、20、25 min，吸取萃取液，使用氣相色譜儀進樣，測取峰面積。

1.2.3.3 萃取液體積對驅(qū)蚊酯峰面積影響的測定將預(yù)處理的15份羊毛分為5組，每組3個重復(fù)，在濃度為1%的驅(qū)蚊酯溶液中浸泡后取出，晾干后分別放入裝有3、5、7、10、13 mL無水乙醇的試管中浸泡10 min，然后在35 ℃的密封條件下萃取20 min，獲得萃取液，使用氣相色譜儀進樣，測取峰面積。

1.2.3.4 羊毛在萃取液中浸泡時間對驅(qū)蚊酯峰面積影響的測定 將預(yù)處理的15份羊毛分為5組，每組3個重復(fù)，在濃度為1%的驅(qū)蚊酯配方溶液中分別浸泡后取出，晾干后放入裝有3 mL無水乙醇的試管中分別浸泡5、10、15、20、25 min，然后在35 ℃的條件下密封萃取20 min，獲得萃取液，使用氣相色譜儀進樣，測取峰面積。

1.2.4 羊毛中驅(qū)蚊酯含量的測定

1.2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 稱取驅(qū)蚊酯標(biāo)準(zhǔn)品75 mg于50 mL容量瓶中，用丙酮定容，制備成1.5 mg/mL的對照品儲備液；另稱取鄰苯二甲酸二甲酯（內(nèi)標(biāo)物）50 mg，置于50 mL容量瓶中，用丙酮定容，制得1 mg/mL的內(nèi)標(biāo)溶液，在4 ℃冰箱保存。用移液槍分別移取對照品儲備液20、60、100、300、800 μL于1 mL容量瓶中，分別加入鄰苯二甲酸二甲酯內(nèi)標(biāo)溶液0.1 mL，用丙酮定容到1 mL，配制成驅(qū)蚊酯質(zhì)量濃度分別為30、90、150、450、1200 μg/mL的系列對照品溶液，進樣測定，以對照品和內(nèi)標(biāo)物的峰面積比（A/Ai）為縱坐標(biāo)，以質(zhì)量濃度比（C/Ci）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4.2 萃取液中驅(qū)蚊酯含量的測定 不同配方浸泡過的羊毛經(jīng)優(yōu)化篩選出的試驗條件處理，吸取萃取液0.9 mL于1 mL的容量瓶中，并加入內(nèi)標(biāo)溶液0.1 mL，得到的加標(biāo)萃取液進樣測定，并計算羊毛上附著的驅(qū)蚊酯含量，計算公式為：

1.2.4.3 回收率和精密度的測定 在50 mL容量瓶中分別加入驅(qū)蚊酯標(biāo)準(zhǔn)品125、250 mg，配制成質(zhì)量濃度分別為2.5、5.0 mg/mL的驅(qū)蚊酯標(biāo)準(zhǔn)溶液。用分析天平稱取2份0.1 g的羊毛，用移液槍在對應(yīng)羊毛上分別緩慢滴加5、10 mg/mL的驅(qū)蚊酯標(biāo)準(zhǔn)溶液100 μL，后轉(zhuǎn)入安瓿瓶中，經(jīng)優(yōu)化篩選出的試驗條件處理后，使用氣相色譜儀進樣，測取實際驅(qū)蚊酯含量，與添加量進行比值，測得500和1000 μg 2個添加水平的回收率。一天內(nèi)試驗重復(fù)3次，計算日內(nèi)精密度；一周內(nèi)試驗重復(fù)3次，測得日間精密度。

1.2.5 驅(qū)避劑緩釋性能測定及其釋放曲線繪制每個處理組取24份經(jīng)過預(yù)處理的羊毛，分成8組（于8個時間點測定），每組3個重復(fù)，放入相應(yīng)驅(qū)避劑配方的樣品和無緩釋成分的對照組（驅(qū)蚊酯水溶液）中充分浸泡后取出，將紙袋打開，使羊毛暴露于空氣中，在留樣室放置（室溫23 ℃±2 ℃、相對濕度40%±5%）。晾干后，取第一組羊毛在優(yōu)化篩選的方法下測定的驅(qū)蚊酯含量為初始含量；之后分別在1、2、3、5、8、12、18 d后取相應(yīng)天數(shù)的羊毛，測定其驅(qū)蚊酯含量，并結(jié)合初始含量換算得到對應(yīng)時間點的驅(qū)蚊酯相對釋放率，繪制不同配方的驅(qū)蚊酯相對釋放曲線。使用SPSS軟件的Kruskal-Wallis H檢驗對不同配方驅(qū)蚊酯驅(qū)避劑在同一時間點的載藥量進行差異性分析，并使用Origin 2018軟件對所得到的不同配方驅(qū)蚊酯釋放曲線進行方程擬合，進而評價A、B、C、D 4種驅(qū)蚊酯制劑的緩釋性能。其中：

2 結(jié)果與分析

2.1 試驗方法的優(yōu)化篩選

2.1.1 萃取溫度對驅(qū)蚊酯峰面積的影響 如圖1所示，在其他條件不變的情況下，萃取溫度在20~35 ℃區(qū)間內(nèi)，驅(qū)蚊酯的峰面積隨著萃取溫度的升高而變大，且相互間存在顯著差異（P＜0.05），當(dāng)溫度為40 ℃時，峰面積與35 ℃時差異不顯著。

圖1 萃取溫度對驅(qū)蚊酯峰面積的影響

2.1.2 萃取時間對驅(qū)蚊酯峰面積的影響 如圖2所示，萃取時間在5～20 min內(nèi)，驅(qū)蚊酯的峰面積隨著萃取時間的增加而變大，峰面積由（598.3±11.0）mAU增加到（2538.9±59.6）mAU，差異顯著（P＜0.05）；在25 min時，驅(qū)蚊酯的峰面積較20 min時變化較小，沒有顯著差異。

圖2 萃取時間對驅(qū)蚊酯峰面積的影響

2.1.3 萃取液體積對驅(qū)蚊酯峰面積的影響 如圖3所示，隨著萃取液用量的減少，驅(qū)蚊酯檢測的峰面積變大，不同體積萃取液之間的驅(qū)蚊酯峰面積差異顯著（P＜0.05），當(dāng)萃取液用量為3 mL時，峰面積最大，為（3134.7±65.3）mAU。

圖3 萃取液體積對驅(qū)蚊酯峰面積的影響

2.1.4 羊毛浸泡時間對驅(qū)蚊酯峰面積的影響 如圖4所示，在5~15 min內(nèi)，隨著羊毛在萃取液中浸泡時間的延長，驅(qū)蚊酯的檢測峰面積也逐漸變大；浸泡時間在15 min時，對應(yīng)的峰面積為（4325.7±14.6）mAU；浸泡時間在20、25 min時，驅(qū)蚊酯峰面積差異不顯著。

圖4 羊毛在萃取液中浸泡時間對驅(qū)蚊酯峰面積的影響

結(jié)合以上結(jié)果，供試羊毛在3 mL無水乙醇中浸泡15 min后，并在35 ℃條件下萃取20 min可以獲取驅(qū)蚊酯的最大檢測峰面積。

2.2 羊毛驅(qū)蚊酯沾染含量的測定

2.2.1 驅(qū)蚊酯的標(biāo)準(zhǔn)曲線 由所測數(shù)據(jù)可知，驅(qū)蚊酯在30~1200 μg/mL時，呈良好的線性關(guān)系。以對照品和內(nèi)標(biāo)物的峰面積比（A/Ai）為縱坐標(biāo)，以質(zhì)量濃度比C/Ci為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。如圖5所示，驅(qū)蚊酯標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為y=0.5195x-0.1351，R2= 0.9996，結(jié)果符合要求。

圖5 驅(qū)蚊酯的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2.2 回收率和精密度的測定 如表1所示，2個驅(qū)蚊酯添加水平的回收率在80%~96%之間，日內(nèi)精密度和日間精密度在2.0%~3.5%之間。

表1 羊毛不同驅(qū)蚊酯滴加水平經(jīng)萃取后的精密度和回收率結(jié)果

2.2.3 不同配方緩釋性能的測定 羊毛上驅(qū)蚊酯載藥量（表2）和釋放率（表3）隨時間的變化情況以及釋放曲線（圖6）表明，各處理組羊毛中在5 d內(nèi)的驅(qū)蚊酯釋放量最大，相對釋放率均在70%以上。對不同處理組進行比較，0 d時各處理組間初始羊毛驅(qū)蚊酯載藥量在9137.2~9488.8 μg之間，相互之間沒有顯著差異。1~8 d內(nèi)，A、C、D組在羊毛中驅(qū)蚊酯載藥量均大于同時期的對照組，且差異顯著（P＜0.05）。D組在1~8 d內(nèi)，每克羊毛驅(qū)蚊酯載藥量分別為（5892.6±178.7）、（4383.0±159.5）、3235.8、2436.6、（1729.8±53.8）μg，顯著大于其他處理組（P＜0.05），其相對釋放率分別為35.5%、52.0%、64.3%、73.3%、81.1%；A、C組8 d內(nèi)每克羊毛驅(qū)蚊酯載藥量均顯著大于對照組，其中A組僅在1 d時其驅(qū)蚊酯載藥量顯著高于C組，在其他檢測時間點與C組均無顯著差異；而B組則在整個試驗過程中每克羊毛中驅(qū)蚊酯載藥量與對照組均沒有顯著差異，各時間點的相對釋放率也較為接近；12~18 d時，A、B、C組及對照組的曲線趨于平緩，變化幅度小，A、B、C 3個處理組每克羊毛中驅(qū)蚊酯載藥量相互之間沒有顯著差異，18 d時各處理組間驅(qū)蚊酯載藥量差異均不顯著，相對釋放率在88.4%~90.9%之間。

圖6 不同處理組驅(qū)蚊酯的相對釋放曲線

表3 不同天數(shù)下每克羊毛驅(qū)蚊酯相對釋放率 %

驅(qū)蚊酯相對釋放曲線的方程擬合如表4所示，在5個處理組所得到的擬合方程中，以一級方程的擬合度最好，R2均在0.95以上。在一級方程的基礎(chǔ)上將各處理組的驅(qū)蚊酯釋放曲線在0~18 d內(nèi)進行積分，結(jié)果顯示D組驅(qū)蚊酯長效驅(qū)避劑的積分面積最小，為1349.35 mAU，小于A、B、C組及對照組的1429.69、1502.42、1431.55、1523.46 mAU。

表4 不同處理組驅(qū)蚊酯相對釋放曲線的擬合方程

3 討論

要對羊毛中驅(qū)蚊酯的含量進行檢測，首先需要建立羊毛中驅(qū)蚊酯含量的檢測方法。在對羊毛中驅(qū)蚊酯萃取溫度的篩選中，適當(dāng)?shù)靥岣咻腿囟龋梢允狗肿娱g的運動速度加快，提高驅(qū)蚊酯在萃取液中的溶解度，進而提升萃取效率［10］。理論上萃取時間太短會導(dǎo)致溶劑和溶質(zhì)達不到良好的接觸，造成萃取效率較低；相應(yīng)地增加萃取時間，可以使萃取更加充分；但當(dāng)萃取時間增加到一定程度時，傳質(zhì)動力的降低使萃取效率達到一定水平后不再增加［11］。萃取液的用量對檢測時的峰面積影響較大，適當(dāng)減少萃取液的用量可以增加萃取液中驅(qū)蚊酯的濃度，進而有效擴大其峰面積；但用量也不能過少，要保證羊毛可以完全浸沒在萃取液中，使羊毛與萃取液的接觸面積達到最大，進而增加驅(qū)蚊酯的峰面積。

在驅(qū)避劑的研制中，除了發(fā)掘更有效、安全的驅(qū)避劑成分之外，另一個研究方向就是采用一些技術(shù)手段延緩驅(qū)避物質(zhì)在使用時的揮發(fā)以及透皮吸收現(xiàn)象，使有效成分長時間附著在保護對象上，從而達到人畜免受吸血寄生蟲侵擾的目的。目前，驅(qū)避劑的主要緩釋手段包括高分子聚合物、微膠囊、包結(jié)化合物、脂質(zhì)體、水凝膠，并可以將其加工成油膏、乳劑、霜膏、噴霧劑、酊劑、氣霧劑、摩絲、粉劑等劑型［12-14］。Chung等［15］采用微膠囊方法，以三聚氰胺-甲醛預(yù)聚物為壁材，以香茅油為芯材，采用原位聚合法制備了含有香茅油的微囊，結(jié)果顯示，該香茅油微囊在常溫下放置8周后，其微囊內(nèi)的香茅油含量依然在80%以上。董桂蕃等［16］開發(fā)了一種以水溶性高分子化合物為載體材料的透明狀水凝膠劑型，與普通酊劑和霜劑比較，明顯延長了驅(qū)避時間，室內(nèi)試驗和現(xiàn)場驅(qū)蚊效果試驗對埃及伊蚊和白紋伊蚊均表現(xiàn)出良好的驅(qū)避效果。Yim等［17］研究了茶樹油（TTO）乳劑和2種環(huán)糊精包結(jié)復(fù)合物的緩釋型（SR）和改性緩釋型（FR）對硬蜱的驅(qū)避效果，結(jié)果顯示，F(xiàn)R在3 d內(nèi)幾乎具有完全驅(qū)避效果（99.5%），到第15天依然可以驅(qū)避49%硬蜱。另外，驅(qū)避劑的使用效果除了受緩釋技術(shù)的影響之外，亦受較多其他因素的影響，如吸血昆蟲的種類、密度、宿主的生理狀態(tài)、個體差異以及使用時的環(huán)境情況等［18-20］。

4 結(jié)論

本研究建立了羊毛中驅(qū)蚊酯氣象色譜法檢測方法，試驗羊毛于3 mL無水乙醇中浸泡15 min后，在35 ℃條件下萃取20 min后羊毛萃取液中可以獲得驅(qū)蚊酯的最大峰面積。在對A、B、C、D 4組不同配方的驅(qū)蚊酯長效驅(qū)避劑緩釋性能測定中，與驅(qū)蚊酯水溶液組相比，A、C、D組制劑均有不錯的緩釋效果，其中D組制劑的緩釋效果最好，可在12 d內(nèi)有效延緩驅(qū)蚊酯的釋放；而B組制劑的緩釋效果不明顯。