基于“新型微生物菌肥研發”培養學生創新能力

李亮 史碩 夏希成 王清昌 霍亞兵

摘 ?要：理論聯系實際，設計一種關于制備微生物菌肥的創新方法。通過植物與微生物的有效聯合，探索微生物對作物的促生效應，從而加深學生對分子生物學理論知識的理解。該課題通過鍛煉學生對基本實驗操作技術如DNA的提取，葉綠素含量測定的掌握以及精密儀器如PCR儀器，色譜儀，凝膠成像系統的使用，培養學生嚴謹扎實的科研作風;通過提出問題-分析問題-解決問題的教學手段，培養學生解決科學問題的邏輯思維能力。該項工作模式為培養具有創新精神和創新能力的新時代大學生奠定堅實的基礎。

關鍵詞：印度梨形孢;小麥;生物菌肥;發酵條件;促生效應

中圖分類號：G642 文獻標志碼：A ? ? ? ? ?文章編號：2096-000X（2022）13-0038-04

Abstract： An innovative method of preparing microbial fertilizer was designed by combining theory with practice. Through the effective combination of plants and microorganisms， promotion effect of microorganism on crop have been explored， which deepen students' understanding of the theoretical knowledge of molecular biology. By training students to master basic experimental operation techniques such as DNA extraction and chlorophyll content determination， as well as the use of precision instruments such as PCR instrument， chromatograph and gel imaging system， students' rigorous and solid style of scientific research were cultivated in this project. Through the teaching method of "question raising， problem analyzing and problem solving"， the logical thinking ability of students to solve scientific problems was cultivated. This work made a solid foundation for the cultivation of innovative spirit and innovative ability of college students in the new era.

Keywords： Piriformospora indica; wheat; biological fertilizer; fermentation conditions; promoting effect

科技創新能力是指通過科學知識的積累和創新性思維揭示客觀事物的本質內在聯系，并在此基礎上產生新穎的、前所未有的思維成果，它是一種開創性的探索未知的心理活動，是人類智慧升華的表示[1]。當代大學生科技創新能力的培養是非常重要而且必要的。創新教育中，注重學生學習興趣的激發、創新精神的培養、潛能的開發、個性的發展和實踐能力的提高，對提高學生綜合素質、增加學生就業機會具有重要意義。

大學生利用課余時間進行創新實驗是培養大學生綜合實驗能力的良好時期。按照提出問題，分析問題，解決問題的思維方式，提出目前在農業化肥使用中存在的問題。通過文獻檢索發現：在過去的幾十年中，傳統化肥的使用極大地促進了農業的發展。但是研究表明，長期施用化肥對土壤養分、結構及生態與環境等方面均產生諸多不良影響， 甚至對人體健康產生嚴重危害[2]。專家指出，開發增產增收并且環保無污染的生物菌肥是發展生態農業、實施農業可持續發展策略的一項重要措施。但是現有生物肥料的菌種與寄主植物相對專一，菌種資源不多、數量偏少、作用也參差不齊，致使實際生產、推廣難度大[3]。

本課題提出利用根際微生物與作物的共生關系，研發一種綠色、安全、無污染的促生型生物肥料，旨在減少因化肥造成的污染，改善土壤結構并彌補現有生物肥料作用寄主植物單一、肥效不穩定等缺陷。該實驗所涉及到的微生物材料是內生真菌印度梨形孢（Piriformosporaindica）[4]，它可以與多種作物，例如玉米、番茄、大豆、水稻、高粱、小麥等[5-7]建立共生關系并能促進作物的生長及產量提高。

該實驗的目的是基于菌肥的制備并探究微生物對作物的促生作用來促進大學生科技創新能力的開發與培養。通過該實驗課程激發學生對科研的興趣，掌握實驗操作中常用儀器的使用和工作原理，學會實驗方法的選擇、原理和操作，以及試驗資料的收集整理，實驗數據的處理和對實驗結果的分析歸納能力。通過該課題的研究，能有效地鍛煉學生理論聯系實踐的能力，有利于提高學生的研究能力、綜合能力和創新能力。

一、選題階段

4個學生組成一個大學生創新創業計劃團隊，首先根據研發技術內容的關鍵詞大量搜索文獻，分析該領域存在的問題，針對問題提出解決方案并進行可行性分析，在此基礎上撰寫選題報告并與指導教師進行探討，明確技術路線，并設計實驗方案，整個過程由學生獨立完成，指導教師最終審核，將實驗課題定為“新型微生物菌肥研發”。

二、實驗階段

（一）實驗材料與設備

CM固體培養基、CM培養液、羧甲基纖維素、1×PBS、滑石粉、鹽酸、氫氧化鉀、臺盼藍、 乳酸酚、瓊脂糖、溴化乙錠、蛭石、珍珠巖、乙醇、次氯酸鈉、甲烯藍、DNA試劑盒、恒溫震蕩培養箱、無菌Buckner漏斗、尼龍布（400 nm）、熒光定量PCR儀、磁力攪拌器、離心機、Bio-rad凝膠電泳成像系統、顯微鏡、高溫高壓蒸汽滅菌鍋等。

（二）實驗步驟

1. 印度梨形孢發酵條件的優化

實驗設置3個溫度梯度組，分別為20℃、23℃和26℃，設置3個不同pH值梯度組，分別是6.0、7.0和7.5，取等量印度梨形孢接種到不同條件下的CM[8]液體培養基中生長，觀察并統計生長情況。

2. 印度梨形孢菌肥的制備

印度梨形孢接種于CM固體培養基中，接種板在23℃的黑暗環境中放置30 d后，收集孢子，接種到培養液中，置于溫度為23℃的恒溫震蕩培養箱中生長30 d。

用無菌Buckner漏斗和尼龍布（400 nm）過濾培養液中的印度梨形孢，用1×PBS洗滌;在培養液中加入羧甲基纖維素（CMC）和印度梨形孢;取CMC懸浮液[9]與無菌滑石粉均勻混合，即制得印度梨形孢菌肥。

3. 小麥種子萌發及實驗室施肥

土壤滅菌后（蛭石∶珍珠巖=2∶1質量比），將菌肥與土壤分別以1∶1，1∶2，1∶3質量配比混合均勻，形成不同比例菌肥實驗設置，以不施肥為空白對照。

將置于4℃冰箱中春化的小麥種子經乙醇、次氯酸鈉溶液無菌處理后，將種子置于土壤中。

4. 印度梨形孢定殖小麥根形態學觀察及真菌18S rDNA擴增鑒定。

施加菌肥3 d后，隨機選取小麥幼苗根系，經臺盼藍[10]溶液過夜染色后，于顯微鏡下觀察印度梨形孢定殖情況。

另選取小麥根系，使用DNA試劑盒提取DNA，經PCR[11]擴增后，進行瓊脂糖凝膠電泳，利用Image Lab 3.0軟件進行分析。

5. 小麥促生效應檢測

待小麥發芽后，統計發芽種子數，計算發芽率，在播種后第7天統計小麥根長、株高;使用乙醇研磨法[12]測得小麥葉綠素含量;使用浸泡法[13]測得小麥電導率，并計算相對電導率;使用甲烯藍比色法[14]測得吸光度，并計算根系的活躍吸收面積比，作為根系活力指標。

（三）結果與分析

1. 發酵條件分析

如圖1所示，在溫度為23℃，pH值為7.0條件下印度梨形孢生物量顯著高于對照，其菌絲致密，孢子濃度大，對照組產生的菌絲透明且稀疏。通過溫度和pH的梯度實驗，明確印度梨形孢最適生長溫度為23℃，pH值為7.0。

2. 印度梨形孢共生小麥根形態學觀察及真菌18S rDNA擴增鑒定

在40×10顯微鏡下可清晰地觀察到該真菌在植物根部定殖有橢圓形的厚垣孢子，如圖2（a）箭頭所示。以提取的DNA為模板，用引物ITS進行PCR擴增，用擴增的rDNA、ITS進行瓊脂糖凝膠電泳。電泳圖譜顯示擴增出的片段大約200 bp （圖2b），可確定有真菌定殖于小麥根部。

3. 小麥促生效應檢測

小麥發芽率和生長參數統計：為了明確印度梨形孢對小麥的促生作用，對小麥發芽率和株高進行了生物學統計。如圖3所示，印度梨形孢對小麥植株的生長有顯著性影響，小麥種子種植在不同比例拌菌土壤中，施有菌肥小麥的發芽率、株高均優于對照，且拌菌比例越高促生效果越明顯。

相對電導率的測定：當植物受到不良環境因素時，能傷害原生質的結構而引起透性改變，細胞內含物外滲，電導率增大;電導率越大，植物受傷愈重，抗性愈弱，反之抗逆能力越強。在生物脅迫方面，印度梨形孢可以誘導植物產生系統抗性，如圖4（a）所示，拌菌比例為1∶1、1∶2、1∶3的實驗組相較于對照，相對電導率均大幅度降低，小麥的抗逆性增強，這有力地說明了印度梨形孢可以誘導植物自身防御機制增強，提高抗逆能力。

葉綠素含量的測定：葉綠素是植物葉片進行光合作用的主要色素，其含量高底在一定程度上反映了植物的光合作用水平。從圖4（b）可以看出，小麥葉片中的葉綠素a、葉綠素b和葉綠素總含量均隨著拌菌比例的提高而增加，與對照相比，有明顯差異。由此得出結論，印度梨形孢定殖小麥可通過增強葉片的光合作用增加有機物的積累。

根系活力的測定：植物根系是活躍的吸收器官和合成器官，根的生長情況和活力水平直接影響地上部分的營養狀況及產量水平，根系活力就是一個表征植物根系的量，這里以根系的活躍吸收面積百分比作為指標。印度梨形孢定殖到作物根部，促使了那些不溶的和凝聚的或者復雜形式的氮、磷的流動，使寄主植物最大限度的運用到土壤中已存在的氮、磷元素，提高根系活力。如圖4（c）所示，拌菌比例為1∶1、1∶2的實驗組根系活力較高，而對照組的根系活力最差。這與不同拌菌比例小麥的生長參數和理化性質表現相一致。

（四）實驗小結

通過“新型微生物菌肥研發”實驗，在教師的指導下，學生獨立規劃和進行實驗，熟練掌握了無菌操作的步驟以及顯微鏡、熒光定量PCR儀、離心機等精密儀器的使用，學會了使用office、origin等軟件進行數據處理，也鍛煉了學生們探索規劃、開拓創新的能力。但由于實驗周期過短，學生課余時間不夠豐裕，導致對本實驗探究不夠深入，具體的實驗結果還需要進行進一步實驗驗證。

三、結束語

學生科技創新實驗是服務新時期高校素質教育的需要，在實驗過程中，學生的創新意識和實踐能力顯著提高，學會將專業基礎理論知識靈活運用到實驗規劃及操作中，逐漸具備主動學習、主動思考以及主動創新的能力，并清楚認識到合作精神是團隊有序運作、實驗有序進行的關鍵。在教師指導下，學生通過“自主查閱文獻-選題-確定實驗方案-進行實驗-不斷摸索、改進創新-得出實驗結論”的流程，提高了科學實踐、科技創新的能力。

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