血清外泌體來源的miR-425-5p與帕金森病認知功能障礙的相關性分析

王男，姚玉芳，張福波，苗娜，徐鑫，楊潮萍

1 滄州市中心醫院神經內科，河北 滄州 061000；2 滄州市中心醫院中醫科

帕金森病（PD）是一種進展緩慢的神經退行性疾病，主要表現為靜止性震顫、步態異常及認知功能障礙（CD）等。據報道，有25%～30%的PD 患者并發CD，其中10%～20%的患者隨病情加重進展為癡呆［1-2］。外泌體中含多種蛋白質和核酸，其作為細胞間信息傳遞的媒介，介導了PD 發病和進展過程［3］。miR-425-5p 作為微小RNA（miRNA）家族中一員，已被報道與PD相關炎癥、神經元凋亡等有關［4］，此外還與阿爾茨海默病中tau 磷酸化和神經元凋亡密切相關［5］。本研究通過分析miR-425-5p 與PD 并發CD 的關系，旨在為PD并發CD的預防和治療提供幫助。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 納入標準：根據《中國帕金森病的診斷標準（2016版）》［6］確診為PD；年齡55～80歲；配合研究相關檢查項目；臨床資料完整。排除標準：伴腦血管疾病、阿爾茨海默病及腦部創傷史；嚴重實質臟器功能異常；精神疾病、血液系統疾病或惡性腫瘤；伴視力、聽力或語言表達障礙等。選取2019年4月—2021 年8 月在滄州市中心醫院就診的PD 患者129 例，其中男73 例、女56 例，年齡55～73（63.75±3.85）歲，體質量指數（BMI）為（25.09 ± 3.13）kg/m2；合并糖尿病史24 例，吸煙43 例，飲酒44 例；學歷高中及以下54 例，大專及以上75 例；收縮壓（SBP）為（137.47±18.03）mmHg，舒張壓（DBP）為（84.02±9.83）mmHg；Hoehn-Yahr（H-Y）分期早期45例、中期69例、晚期15例。本研究經滄州市中心醫院醫學倫理委員會批準，受試者均簽署知情同意書。

1.2 CD 診斷標準 于PD 患者就診當天，使用MoCA 量表評價其認知功能，該量表包含7 個維度，分別為命名、注意、語言、抽象、視空間與執行、延遲記憶、定向，總分30分（受試者受教育年限≤12年者，總分加1 分）。總分0～9 分為重度，10～20 分為中度，21～26分為輕度，27～30分為正常。

1.3 血清外泌體中miR-425-5p 檢測 抽取PD 患者外周靜脈血10 mL，用ExoQuick 外泌體快速提取試劑盒（美國SBI 公司）提取血清中的外泌體，用實時熒光定量PCR（RT-qPCR）法檢測miR-425-5p 水平。用TRIzol 試劑提取外泌體中總RNA，紫外分光光度計檢測其純度，用逆轉錄試劑盒（日本TAKARA 公司）將RNA 反轉錄為cDNA。用CFX96型實時熒光定量PCR 儀（美國Bio-Rad 公司）擴增產物，擴增條件：95 ℃預變性30 s，95 ℃變性5 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，40 個循環。引物序列：miR-425-5p上游：5＇-GGGGAGTTAGGATTAGGTC-3＇，下游5＇-TGCGTGTCGTGGAGTC-3＇；內 參U6 上 游5＇-CTCGCTTCGGGCAGCACA-3＇；下 游5＇-AACGCTCTCACGAATTTGCGT-3＇。引物序列由上海吉瑪制藥技術有限公司設計。用2-ΔΔCt法計算miR-425-5p 的相對表達量。

1.4 統計學方法 采用SPSS23.0 統計軟件。用Shapiro-Wilk檢驗判斷計量資料是否服從正態分布，符合正態分布的計量資料以xˉ±s表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗；計數資料用例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。用Pearson 相關分析miR-425-5p 與MoCA 量表評分的關系；用受試者工作特征（ROC）曲線評價miR-425-5p 判斷PD 并發CD 的價值；用Logistic 回歸分析miR-425-5p 與PD 并發CD 的關系。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PD患者并發CD的情況 129例PD患者中，并發CD 47例，其中輕度41例、中度6例。

2.2 CD與非CD患者臨床資料比較 CD患者男25例、女22 例，年齡（63.81 ± 3.65）歲，BMI（24.85 ±3.14）kg/m2，有糖尿病史10例、吸煙史18例、飲酒史21例，學歷高中及以下27例、大專及以上20例，SBP（145.04 ± 19.21）mmHg、DBP（84.77 ± 8.13）mmHg，H-Y 分期早期4 例、中期32 例、晚期11 例；非CD 患者男25 例、女22 例，年齡（63.72 ± 3.99）歲，BMI（25.27±3.14）kg/m2，有糖尿病史14例、吸煙史25 例、飲酒史23 例，學歷高中及以下27 例、大專及以 上55 例，SBP（133.12 ± 15.86）mmHg、DBP（83.59±10.70）mmHg，H-Y 分期早期41例、中期37例、晚期4例。CD患者高中及以下學歷占比、SBP和H-Y 中晚期占比均高于非CD 患者（P均＜0.05），二者年齡、性別、BMI、糖尿病史、吸煙史、飲酒史、DBP水平比較差異均無統計學意義（P均＞0.05）。

2.3 CD 與非CD 患者外泌體miR-425-5p 水平比較 CD患者外泌體miR-425-5p表達量為0.66±0.10，低于非CD患者的0.84±0.13（t=8.379，P＜0.01）。

2.4 PD 患者miR-425-5p 與MoCA 量表評分的相關性 miR-425-5p 與MoCA 量表中語言、抽象、視空間與執行、延遲記憶和總分均呈正相關（r分別為0.339、0.489、0.347、0.555、0.541，P均＜0.01）。

2.5 miR-425-5p 對PD 并發CD 的診斷效能 miR-425-5p 診斷PD 并發CD 的ROC 曲線下面積為0.876（95%CI為0.810～0.943），最佳截斷值為0.71，靈敏度和特異度分別為82.98%和87.80%。

2.6 miR-425-5p與PD并發CD的關系 將PD是否并 發CD 作 為 因 變 量，將 飲 酒 史（χ2=3.677，P=0.055）、學歷、SBP、H-Y 分期、miR-425-5p 作為自變量（變量賦值：飲酒史無=0，有=1；學歷高中及以下=0，大專及以上=1；SBP≤155 mmHg=0，＞155 mmHg=1；H-Y 分期早期=1，中期=2，晚期=3；miR-425-5p≤0.71=0，＞0.71=1；并 發CD 否=0，是=1），納 入Logistic 回歸分析，結果顯示，大專及以上學歷、miR-425-5p＞0.71 是PD 并發CD 的獨立保護因素，SBP＞155 mmHg 是PD 并發CD 的獨立危險因素（P＜0.05或＜0.01）。見表1。

表1 PD并發CD影響因素的Logistic回歸分析結果

3 討論

PD 發病人群主要是老年人，隨著中國人口老齡化加重，PD 發病率將進一步升高，PD 并發CD 的患者數量勢必會隨之增長。目前，對于PD 并發CD 患者多采用藥物治療，如卡巴拉汀和左旋多巴片等，可在一定程度上提高患者的認知功能和生活能力，但部分患者治療獲益甚微，預后不佳［7-8］。若在PD 并發CD 早期及時給予干預，可有效抑制病情進展，提高患者生活質量。目前，臨床尚缺乏診斷效能高的指標用于早期識別PD 并發CD，本文通過研究miR-425-5p 與PD 并發CD 的關系，以期為PD 并發CD 的早期預防和治療提供幫助。

既往研究顯示，miR-425-5p 與惡性腫瘤如結直腸癌［9］、卵巢癌［10］、非小細胞肺癌［11］及肝細胞肝癌［12］等的發病和進展有關。新近研究發現，miR-425-5p過表達可通過抑制炎癥和氧化應激來減弱魚藤酮誘導的PD 大鼠模型的神經元凋亡、Th 陽性細胞丟失和小膠質細胞活化［4］。此外，在阿爾茨海默病樣細胞模型中，miR-425-5p 還可靶向熱休克蛋白B8，促進細胞中的tau 磷酸化和神經元凋亡［5］。HU 等［13］報道，miR-425 缺乏可促進PD 小鼠模型的神經元壞死性凋亡和多巴胺能神經變性。miR-425-5p可靶向沉默信息調節因子1/核因子-κB 信號通路抑制缺血性卒中小鼠的小膠質細胞炎癥反應和血腦屏障損傷［14］。小膠質細胞在PD 發病進展過程中扮演著雙重角色，靜息態的小膠質細胞被激活，可釋放促炎因子，加重炎癥反應；活化的小膠質細胞可釋放抗炎因子，修復并保護神經元。本研究結果顯示，CD 患者miR-425-5p水平低于非CD患者，提示PD并發CD后miR-425-5p 水平降低。Pearson 相關分析結果顯示，miR-425-5p 與MoCA 量表中語言、抽象、視空間與執行、延遲記憶和總分均呈正相關關系，表明miR-425-5p 可能通過影響PD 患者負責語言、抽象、視空間與執行和延遲記憶相關腦部區域功能參與CD 發病。ROC 曲線分析結果顯示，miR-425-5p 判斷PD 并發CD 的ROC 曲線下面積為0.876，提示miR-425-5p 對PD并發CD有一定的判斷價值，可輔助臨床決策。

本研究Logistic 回歸分析結果顯示，miR-425-5p＞0.71 是PD 并發CD 的獨立保護因素，推測其原因是外泌體中miR-425-5p水平與腦部氧化應激、tau磷酸化和神經元凋亡等有關，其水平可反映PD患者的腦部結構和功能的病變情況。既往研究結果顯示，年齡和受教育程度與PD 患者并發CD 有關［15-16］。本研究結果顯示，大專及以上學歷是PD 并發CD 的獨立保護因素，與既往研究結果相符。本研究未將年齡納入Logistic 回歸分析，其原因在于：一是PD 發病人群主要為老年人，為保證收集到足夠多的PD患者進行研究，對年齡做了一定限制；二是為避免影響miR-425-5p分析結果，年齡作為混雜因素，易影響分析結果的準確性；三是本研究中受試者對象年齡分布較為緊密，差異不顯著。SHAH 等［17］研究發現，SBP 水平與腦血流關系密切，較高的SBP 可誘發腦結構改變，進而破壞腦組織；隨著SBP 升高，腦內β淀粉樣蛋白沉積增加，導致CD 發病風險增加。本研究結果顯示，SBP＞155 mmHg 是PD 并發CD 的獨立危險因素，表明SBP 升高增加了PD 并發CD 的發病風險，提示應重點關注高SBP 的PD 患者，避免其并發CD。

綜上所述，血清外泌體來源的miR-425-5p 水平低與PD 并發CD 有關。本研究上存在一定局限性，一是受試對象均來自于同一家醫院，且樣本量有限，樣本選擇上可能存在一定偏倚，后續將開展多中心、大樣本研究；二是本研究受試對象均為首次確診的PD 患者，對于已接受治療的PD 患者，miR-425-5p 是否可用于并發CD 的判斷還未可知，有待進一步深入研究。