CXCL5基因敲除小鼠抑郁樣行為及血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平變化

袁東亮，權偉，陳奕晨，龔陽澤，劉凌之，邵青，翟媛媛，趙正杭

1 西安交通大學基礎醫學院，西安 710061；2 空軍軍醫大學唐都醫院藥劑科；3 西安市精神衛生中心藥劑科

傳統觀念認為，由于血腦屏障的存在，中樞神經系統通常被視為“免疫豁免區”；但近年研究顯示，在中樞神經系統內也可出現炎癥介質水平增高［1］。神經炎癥假說在抑郁癥病理機制中具有重要作用［2］。有研究表明，通過基因芯片篩選抑郁癥小鼠海馬組織中差異表達的炎癥因子基因，發現CXC 趨化因子配體5（CXCL5）表達差異最為明顯。趨化因子是一類小分子堿性蛋白，主要功能是趨化細胞定向移動。CXCL5 為趨化因子CXC 家族成員，主要表達于中性粒細胞、單核細胞，也可表達于嗜酸性粒細胞。中性粒細胞是先天性免疫監視的重要組成部分，同時在炎癥導致的病理損傷中發揮重要作用［3］。研究顯示，CXCL5 信號通路與神經炎癥及血腦屏障損傷相關，并可導致腦白質損傷［4］。另有學者發現，CXCL5 與創傷性腦損傷、人腦內皮屏障破壞等相關［5］。CXCL5與抑郁癥的關系及其相關機制需要進一步驗證。2021 年6 月—2022 年1 月，我們通過繁殖CXCL5 基因敲除小鼠，并進一步構建抑郁癥模型，觀察其行為學及血清炎癥因子水平，初步探討CXCL5在抑郁癥發生發展中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與材料

1.1.1 實驗動物 新生CXCL5＋/－雜合子小鼠4只，5～6 周齡，雌雄各半，體質量（18±2）g，購自廣州賽業生物科技有限公司。小鼠飼養于空軍軍醫大學實驗動物中心SPF級動物房，室內溫度20～25 ℃，濕度50%～60%。每周換2 次墊料，隔天添加食物和水。新生C57野生型小鼠16只，4周齡，雌雄各半，體質量（18±2）g，購自空軍軍醫大學實驗動物中心。

1.1.2 主要試劑與儀器 TreliefTMMouse Direct PCR Kit（Genotyping）試劑購自北京擎科生物科技有限公司；DL1000 bp DNA Maker 購自寶生物（大連）有限公司；瓊脂糖粉購自德國Sigma 公司；引物由北京擎科生物科技有限公司合成。Mini-Sub cell G 電泳儀及凝膠成像儀購自美國Bio-Rad公司；PCR儀器購自Applied Biosystems 公司；低溫高速離心機購自德國Hettich 公司。TNF-α、IL-1β、IL-6 ELISA 試劑盒購自北京百奧萊博科技有限公司。

1.2 CXCL5＋/－雜合子小鼠的繁殖 取飼養12周達到性成熟的CXCL5＋/－雜合子小鼠，雌雄配對分為兩籠進行繁殖。取繁殖后的子代小鼠行基因型鑒定。

1.3 子代小鼠基因型的鑒定 取出生4 周的子代小鼠，剪取小塊鼠尾，采用qRT-PCR 法進行基因型鑒定。提取組織DNA，使用NanoDrop2000超微量分光光度計檢測DNA 的質量濃度和純度。按照TreliefTMMouse Direct PCR Kit（for Genotyping）試 劑盒操作說明進行擴增，引物序列：CXCL5 敲除型上游 5＇-AAGACGACGGACGTGGGGTT-3＇，下 游 5＇-GGAGGGAAAGCCTATTTGGC-3＇，條帶長度856 bp；CXCL5 野 生 型 上 游5＇-CATGTTTGAATATGGATTGCTGAG-3＇，下游5＇-GGAGGGAAAGCCTATTTGGC-3＇，條帶長度711 bp。擴增體系：2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，無酶水9.5 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，DNA 模板1 μL。擴增條件：94 ℃5 min；94 ℃30 s，60 ℃30 s，72 ℃30 s，共35 個循環；72 ℃7 min。取擴增產物5 μL，加入1.5%瓊脂糖凝膠電泳，電壓60～100 V，電泳30 min 后取出，凝膠成像儀觀察結果。純合子（CXCL5＋/＋）基因型的擴增產物為711 bp，純合子（CXCL5－/－）基因型的擴增產物為856 bp，均在凝膠成像顯示為一個條帶。雜合子（CXCL5＋/－）基因型的產物為711 bp 及856 bp，在凝膠成像顯示為兩個條帶。

1.4 CXCL5－/－小鼠的篩選 雌雄雙雜合子交配，其子代可能出現純合子CXCL5＋/＋、雜合子CXCL5＋/－和純合子CXCL5－/－3 種基因型。鑒定為CXCL5－/－的子代小鼠用于繼續繁殖，CXCL5＋/＋及CXCL5＋/－小鼠不是實驗所需，全部處死。因抑郁癥小鼠在造模過程中可能發生死亡，為了保證足夠數量進行體質量監測和行為學評估、血清檢測，故待CXCL5－/－小鼠繁殖至30 只再開始后續實驗。最終獲得16只雌性、14只雄性CXCL5－/－小鼠。

1.5 小鼠體質量檢測 取CXCL5－/－小鼠和C57 野生型小鼠各8只，雌雄各半，記錄小鼠4、6、8、10周齡時的體質量。

1.6 小鼠抑郁癥模型的建立 由于雌鼠性激素水平波動明顯，抑郁模型不穩定，故只取雄鼠建立抑郁癥模型。取10 周齡雄性CXCL5－/－小鼠和雄性C57野生型小鼠，以慢性不可預見性的溫和刺激（CUMS）配合孤養建立抑郁癥模型［6］。小鼠單獨飼養，1 只/籠。CUMS 刺激因素：①45℃熱刺激5 min；②夾尾5 min；③6 ℃冷水游泳5 min；④搖晃5 min；⑤夜間強光照射5 min；⑥禁食24 h；⑦禁水24 h。在28 d 內每天隨機給予上述1 種刺激，使小鼠不能預料刺激的發生，以避免產生適應，每種刺激實施4次。以小鼠出現自主活動明顯減少為造模成功。

1.7 小鼠抑郁癥的行為學評估 取小鼠進行抑郁癥行為學評估。①強迫游泳實驗（FST）：將小鼠放進盛水的透明玻璃杯中，水溫（22 ± 1）℃，水深12 cm。實驗持續6 min，使用高清數碼攝像機記錄小鼠的活動，采用雙盲法統計后4 min內小鼠在水中一動不動的時間。②懸尾實驗（TST）：將小鼠尾巴用膠帶固定懸掛起來，固定位置在距離尾尖約1 cm處，小鼠頭距離放置固定平臺的桌面約10 cm。實驗持續6 min，使用高清數碼攝像機記錄小鼠的活動，采用雙盲法統計小鼠在6 min內不動的總時間。1.8 小鼠血清炎癥因子檢測 行為學評估結束后，小鼠腹主動脈取血，室溫靜置30 min，4 ℃下4500 r/min 離心5 min，分離血清。按照ELISA 試劑盒說明書方法檢測血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平。

1.9 統計學方法 采用GraphPad Prism 統計軟件。符合正態分布的計量資料以-x±s表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CXCL5－/－小鼠與野生型小鼠的體質量比較雄性及雌性CXCL5－/－純合子小鼠在4、6、8、10 周齡時的體質量與同周齡、同性別野生型小鼠比較，差異均無統計學意義（P均＞0.05）。見表1。

表1 CXCL5－/－小鼠與野生型小鼠4、6、8、10周齡的體質量比較（g，±s）

表1 CXCL5－/－小鼠與野生型小鼠4、6、8、10周齡的體質量比較（g，±s）

組別CXCL5－/－小鼠雌性雄性野生型小鼠雌性雄性n 8 4 4 8 4 4體質量第4周10.12±0.6512.08±0.9711.22±0.7312.56±1.24第6周17.78±0.8719.25±0.6618.21±0.6520.23±1.46第8周19.73±0.4522.45±1.5420.21±0.9823.72±1.13第10周20.72±1.5323.68±1.6021.13±1.5224.43±1.41

2.2 CXCL5－/－與野生型抑郁癥小鼠行為學比較CXCL5－/－抑郁癥小鼠的TST、FST 實驗不動時間均較野生型抑郁癥小鼠縮短（P均＜0.05）。見表2。

表2 CXCL5－/－與野生型抑郁癥小鼠抑郁癥行為學比較（min，±s）

表2 CXCL5－/－與野生型抑郁癥小鼠抑郁癥行為學比較（min，±s）

注：與野生型比較，*P＜0.05。

組別CXCL5－/－小鼠野生型小鼠n 8 8 TST實驗不動時間1.64±0.36*2.14±0.41 FST實驗不動時間0.71±0.21*1.50±0.23

2.3 CXCL5－/－與野生型抑郁癥小鼠血清炎癥因子水平比較 CXCL5－/－抑郁癥小鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6 水平均較野生型抑郁癥小鼠降低（P均＜0.05）。見表3。

表3 CXCL5－/－與野生型抑郁癥小鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平比較（pg/mL，±s）

表3 CXCL5－/－與野生型抑郁癥小鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平比較（pg/mL，±s）

注：與野生型比較，*P＜0.05。

組別CXCL5－/－小鼠野生型小鼠n 8 8 TNF-α 427.4±124.1*566.4±127.5 IL-1β 85.8± 9.1*121.9±20.4 IL-6116.9±11.4*149.4±17.0

3 討論

抑郁癥是一種常見且容易復發的精神疾病，其病因復雜，主要由遺傳、代謝和社會因素等多方面因素影響，具體的發病機制尚不明確。其中免疫介導的抑郁癥機制深受研究者的關注，以往對精神疾病的免疫機制研究主要集中在促炎細胞因子方面，大量臨床實驗研究顯示抑郁癥與中樞和外周血中促炎癥因子的增加有關，外周血中炎癥因子可通過特異性轉運蛋白跨過血腦屏障的方式在腦中擴散，激活或參與腦部炎癥反應，最終影響腦部情緒調節區域的神經元活動和神經遞質的釋放，進而引發抑郁癥狀［7］。先前的研究忽略了其他免疫蛋白，如趨化因子。目前研究表明，趨化因子在多種精神疾病如抑郁癥［8］的發生過程中起重要作用，這一作用已超出其經典趨化作用，主要包括神經調節作用，神經遞質樣作用，直接或間接神經生成調節作用［9］。相關的趨化因子包括CXC 趨化因子配體8、CC 趨化因子配體（CCL）2、CCL3、CCL5。這些蛋白可能成為未來診斷及治療抑郁癥新的標志物或治療新靶點。

我們的前期研究采用炎癥細胞因子與受體PCR芯片，檢測了84個炎癥細胞因子基因在應激性抑郁癥小鼠腦區差異表達情況，篩選出趨化因子CXCL5［3］；認為該基因可能成為未來診斷及治療抑郁癥新的標志物或治療靶點。但是CXCL5參與抑郁癥發生的機制仍不十分清楚。因此，CXCL5基因敲除小鼠可為進一步研究該基因與抑郁癥的相關性奠定基礎。

我們使用4只CXCL5＋/－雜合子小鼠進行繁殖獲得CXCL5－/－純合子小鼠，并采用PCR法鑒定了子代的基因型。經鑒定為的純合子的雌雄小鼠，進一步繁殖備用，并對基因敲除型及野生型小鼠的體質量進行監測。這是因為該基因敲除小鼠為完全基因敲除技術，通過體質量監測初步來評估基因敲除對小鼠的健康生長是否有較大影響。通過研究發現兩組體質量無顯著差異，證明該基因的敲除對小鼠的健康影響不大，可進行下一步抑郁樣行為學實驗研究。

CUMS 模擬了部分應激原，外部環境刺激，經過4 周的應激刺激會使動物機體的功能障礙，導致抑郁癥的發生。CUMS 造模后動物出現體運動能力降低，快感缺乏及血漿皮質激素升高等均與人類抑郁癥狀相似，能較真實地模擬抑郁癥病人的某些病因和癥狀，因此是比較理想可靠的抑郁動物模型［10］。FST 實驗是評價抑郁樣行為的經典實驗方法，通過直接觀察小鼠強迫游泳6 min內后4 min的不動時間來判斷抗抑郁反應。不動時間越長，抑郁作用越強。TST 實驗是一種經典而又能快速評價抑郁的方法。其原理是利用小鼠懸尾后企圖逃脫但又無法逃脫，從而放棄掙扎，進入特有的抑郁不動狀態，實驗過程中記錄動物不動時間來反映抑郁狀態。本研究結果顯示，CXCL5－/－小鼠和野生型小鼠在應激性抑郁狀態下的行為學特征，發現CXCL5－/－小鼠的強迫游泳不動時間及懸尾不動時間均顯著縮短，證明該基因可能與小鼠抑郁樣行為有關；提示CXCL5 的敲除阻斷了應激引起的小鼠抑郁樣行為。

IL-1β是IL-1家族中的重要成員，由于其在炎癥相關疾病中的重要作用而備受關注。IL-1β 具有較強的促炎活性，可誘導多種促炎介質，如細胞因子和趨化因子［11］。與IL-1β相似，TNF-α是一種多效性促炎細胞因子，屬于TNF 配體超家族。TNF-α 在調節多種發育和免疫過程中發揮不同的作用，包括炎癥、分化、脂質代謝和凋亡等，與多種疾病的發生發展有關［12-13］。IL-1β 的局部激活是介導促炎反應的中心環節，導致繼發性炎癥介質（包括IL-6）的激活［14］。有研究顯示，TNF-α、IL-1β、IL-6 等在腦梗死后抑郁癥患者的血清中升高，而抗抑郁藥物能降低以上炎性因子［15-16］。本研究結果顯示，野生型抑郁癥小鼠血清炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6 等均升高，而CXCL5－/－抑郁癥小鼠血清炎癥因子水平降低，說明敲除CXCL5 能夠減輕抑郁小鼠血清炎癥因子水平，提示敲除CXCL5 可能在一定程度上減輕抑郁造成的炎癥級聯反應。綜上所述，本研究采用CXCL5＋/－雜合子小鼠成功繁殖獲得CXCL5－/－純合子小鼠；CXCL5的敲除阻斷了應激引起的小鼠抑郁樣行為，并在一定程度上減輕了抑郁造成的炎癥級聯反應。這將為CXCL5與抑郁癥發病機制的深入研究奠定基礎。