顳葉癲癇患者外周血6種X連鎖基因DNA甲基化水平變化及其與臨床特征的關系

周煦，肖琳，陳增強，吳健豪，陶華，李克深

1 廣東醫科大學附屬醫院神經內科中心，廣東湛江 524001；2 暨南大學附屬第一醫院臨床醫學研究中心

癲癇是神經系統常見疾病之一，除了后天環境因素和獲得性疾病，遺傳因素在癲癇的發生發展過程中發揮重要作用［1］。相比于常染色體上的基因突變，X 連鎖遺傳性癲癇相對復雜，常為癲癇性腦病或癲癇綜合征，其表現形式多樣，可能與遺傳機制的多樣性相關，涉及基因突變、甲基化、X 染色體隨機失活以及嵌合體等［2-3］。近年來，X 連鎖遺傳性癲癇逐漸受到關注，探明其分子機制有助于拓展癲癇的病理機制。表觀遺傳指DNA 序列不發生變化，但基因表達卻發生了可遺傳的改變。DNA 甲基化是表觀遺傳的表現形式之一，在基因啟動子及其鄰近外顯子區域的CpG 島甲基化異常增高，可抑制相關基因轉錄活性，導致轉錄沉默，反之可導致基因表達異常增強，從而參與疾病的發生發展過程［4-5］。與經典遺傳學的基因突變相比，DNA 甲基化和去甲基化可在后天根據生長發育和環境適應需要而轉換，且這種改變在發育和細胞增殖過程中能穩定傳遞，非常有利于研究遺傳和環境交互影響性疾病，并成為癲癇病理機制研究的重要方向之一［6］。近年來，有學者根據癲癇性腦病患者全外顯子測序鑒定新發突變并對其進行功能分析，篩選出一系列癲癇致病基因，其中可見多個X 連鎖基因，CASK、CDKL5、IQSEC2、MECP2、PCDH19 和WDR45［7］。考慮到顳葉癲癇是難治性癲癇的主要來源，而癲癇性腦病相關致病基因可能成為其機制研究的突破口，故本研究以上述6 個癲癇相關X 連鎖基因為基礎，系統評估這些基因在顳葉癲癇患者中是否受到DNA 甲基化調控，旨在為顳葉癲癇的診治提供新線索。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集廣東醫科大學附屬醫院診治的顳葉癲癇患者38 例（癲癇組），男18 例、女20 例，年齡（32.1 ± 14.4）歲，發病年齡（23.3 ± 16.2）歲，病程（8.8 ± 9.8）年。根據2010 年國際抗癲癇聯盟制定的標準［8］，評估患者的抗癲癇藥物反應，耐藥14例、敏感24例。另收集同期我院健康對照38例作為對照組，男19 例、女19 例，年齡（33.4±6.4）歲。兩組性別、年齡具有可比性。本研究獲廣東醫科大學附屬醫院倫理委員會批準，所有研究對象已獲得知情同意。

1.2 主要試劑和儀器 主要試劑：DNA 抽提試劑盒、凝膠回收試劑盒（北京天根生化科技公司），EZ DNA 甲基化試劑盒（美國CA 公司），HotStart Taq DNA 聚合酶（大連寶生物工程有限公司）。主要儀器：ABI 2720 PCR 擴增儀（美國ABI 公司），Eppendorf 5810R 離心機（德國漢堡公司），Agilent 2100 生物分析儀（美國安捷倫公司），cBot Cluster測序平臺、高通量測序儀（美國Illumina公司）。

1.3 X 連鎖基因CpG 島的分布情況評估與提取評估X 連鎖基因CASK、CDKL5、IQSEC2、MECP2、PCDH19、WDR45 啟動子區及其鄰近第一外顯子區（-2 kb～1 kb）CpG 島的分布情況，具體參數：觀察/預測比值＞0.60，長度＞200 bp，C+G 比例＞50%。基于人類基因組GRCh37/hg19 版本（CBI37/hg19），提取CpG島所在區域的DNA片段。

1.4 X 連鎖基因CpG 島擴增引物序列的設計 委托上海天昊生物科技有限公司，利用其內部軟件設計，獲得可在同一體系能夠對重亞硫酸鹽處理后的目的片段進行多重擴增的特異性引物19對；基于各個基因CpG 島數量和序列長度不同，所需引物不完全相同（見表1）；根據引物長度和GC 含量等特性，利用該公司內部軟件模擬優化各條引物在同一體系的配置濃度，以達到體系反應的高效率和產物的特異性。

表1 X連鎖基因CpG島擴增引物序列

1.5 X連鎖基因CpG島的甲基化檢測 采用亞硫酸氫鹽轉化技術，由上海天昊生物科技有限公司提供技術支持。收集受試者外周靜脈血3 mL，使用DNA抽提試劑盒和Eppendorf 5810R 離心機提取DNA。使用EZ DNA甲基化試劑盒，將未甲基化的堿基C轉化為U。利用HotStar Taq聚合酶，以重亞硫酸鹽處理后的DNA 為模板，通過ABI2720 PCR 擴增儀和特異性引物混合液擴增目的片段。使用TIANGEN 凝膠回收試劑盒，分離并提取擴增產物。用帶有Index序列的引物，向文庫末端引入與Illumina 平臺兼容的特異性標簽序列。獲得帶標簽的文庫后，利用Illumina cBot Cluster 平臺和Illumina 高通量測序儀，以2×150 bp 的雙端測序模式進行高通量測序。以Agilent 2100 生物分析儀進行質量控制和數據處理，獲得等位基因C 和等位基因C+U 的讀數，二者比值×100%即為X 連鎖基因CASK、CDKL5、IQSEC2、MECP2、PCDH19、WDR45的DNA甲基化率。

1.6 統計學方法 采用SPSS19.0 統計軟件。數據結果以-x±s表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組X 連鎖基因DNA 甲基化率比較 癲癇組和 對 照 組X 連 鎖 基 因CASK、CDKL5、IQSEC2、MECP2、PCDH19、WDR45 基因甲基化率比較，差異均無統計學意義（P均＞0.05）。見表2。

表2 兩組X連鎖基因DNA甲基化率比較（%，±s）

表2 兩組X連鎖基因DNA甲基化率比較（%，±s）

組別癲癇組對照組P n 3838 CASK 19.88±14.1712.82±14.110.033 CDKL522.64±7.0318.93±7.080.025 IQSEC24.25±2.693.42±3.120.217 MECP218.76±12.8911.84±12.270.019 PCDH1930.75±14.6924.97±13.570.079 WDR4532.29±9.3827.21±8.650.016

2.2 不同基線特征的顳葉癲癇患者X 連鎖基因DNA 甲基化率比較 男性X 連鎖基因CASK、CDKL5、IQSEC2、MECP2、PCDH19、WDR45 甲基化率均低于女性（P均＜0.05），不同年齡、發病年齡、病程、抗癲癇藥物反應患者X 連鎖基因甲基化率比較差異無統計學意義（P均＞0.05）。見表3。

表3 不同基線特征的顳葉癲癇患者X連鎖基因DNA甲基化率比較（%，±s）

表3 不同基線特征的顳葉癲癇患者X連鎖基因DNA甲基化率比較（%，±s）

基線特征性別男女OR P入組年齡＜26歲≥26歲OR P發病年齡＜18歲≥18歲OR P病程＜5年≥5年OR P抗癲癇藥物反應敏感耐藥OR P n 18201919191919192414 CASK 6.73±8.3731.72±4.170.210.00019.49±14.1420.27±14.580.960.86720.89±13.2518.87±15.331.110.66716.51±14.1423.25±13.750.710.14517.82±14.4321.08±14.190.850.501 CDKL516.39±4.8028.26±2.310.580.00022.52±6.8022.76±7.430.990.91923.05±6.5722.23±7.621.040.72221.47±7.3323.81±6.710.900.31221.26±6.7423.44±7.200.910.362 IQSEC21.92±1.506.35±1.530.300.0003.97±2.424.54±2.980.870.5194.44±2.674.07±2.781.090.6823.59±2.454.92±2.820.730.1303.52±2.264.68±2.870.750.202 MECP27.01±8.8229.33±2.350.240.00018.66±12.9818.86±13.160.990.96319.88±12.3217.64±13.681.130.60115.88±13.1821.63±12.270.930.17216.80±13.4619.90±12.700.840.482 PCDH1917.32±9.7942.83±3.140.400.00030.06±15.1031.43±14.650.960.77931.72±14.1929.77±15.501.070.68827.53±14.7733.96±14.270.810.18028.51±14.6532.05±14.860.890.482 WDR4523.52±6.0540.14±1.220.590.00032.23±9.3832.35±9.641.000.96833.32±9.2431.26±9.651.070.50730.10±9.1834.48±9.300.870.15231.35±10.3132.83±8.980.950.645

2.3 不同性別健康對照人群X 連鎖基因DNA 甲基化率比較 在健康對照人群中，男性X 連鎖基因CASK、CDKL5、IQSEC2、MECP2、PCDH19、WDR45甲基化率均低于女性（P均＜0.05）。見表4。

表4 男性和女性對照X連鎖基因DNA甲基化率比較（%，±s）

表4 男性和女性對照X連鎖基因DNA甲基化率比較（%，±s）

性別男女P n 1919 CASK 3.27± 1.1822.37±14.670.000 CDKL514.44±0.7823.43±7.740.0000 IQSEC21.55±0.255.29±3.550.000 MECP23.51± 0.5820.17±12.760.000 PCDH1915.64± 2.4034.31±13.740.000 WDR4521.39±0.4533.03±9.060.000

3 討論

盡管新型抗癲癇藥物被陸續應用于臨床，大多數患者能夠得到有效控制，但是仍然有約30%癲癇患者發展為耐藥性癲癇［4］。一旦癲癇患者病情得不到有效控制，將嚴重影響其學習、生活和工作能力，并給所在家庭和社會造成嚴重的疾病負擔。顳葉癲癇是成人癲癇最常見的發作類型，約有80%的顳葉癲癇患者抗癲癇藥物治療效果不佳，是耐藥性癲癇的最主要來源。因此，本研究以顳葉癲癇患者為研究對象，積極從新的角度探索其病理機制，對于整體改善癲癇患者診治水平具有重要意義。

X 連鎖遺傳性癲癇常見頻繁的癇性發作，發作間期大量放電，常伴有認知和精神行為改變，病理改變包括突觸異常新生、神經元遷移和分化障礙、神經遞質合成和釋放障礙、膜受體結構和功能障礙等［10］。X 連鎖致病基因及相關癲癇發作常呈早發性、難治性甚至災難性，常表現為癲癇性腦病和癲癇綜合征。MECP2 是具有結合DNA 甲基化序列的核蛋白家族成員之一，具有抑制基因轉錄的生物學效應，其基因突變或缺失引起Rett 綜合征［11-12］。CDKL5 是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶在神經發育中發揮重要作用，其基因突變可導致新生兒在數周內表現出耐藥性癲癇，在臨床上與X 連鎖West 綜合征和Rett 綜合征密切相關［13］。CASK 是鈣依賴絲氨酸蛋白激酶，在腦內突觸區域富集，該蛋白基因編碼序列第21 外顯子區移碼突變c.1896dupC＜p.C633fs（*）2可導致患者自幼癲癇成簇發作，抗癲癇藥物難以有效控制［14］。IQSEC2是鳥嘌呤核苷酸交換因子，在興奮性神經元突觸后膜上發揮作用，其基因功能缺失突變可導致X 連鎖智力障礙和早發性癲癇［15］。PCDH19 是主要表達于腦內的鈣依賴細胞黏附蛋白，其基因突變表現為兒童起病的短暫而成簇的驚厥發作，伴有認知損害和行為異常［16］。WDR45 是WD 重復片段蛋白家族成員之一，參與細胞周期、信號轉導、凋亡和基因表達調控等生物學活動，多個位點基因突變可導致患者發育遲緩和癲癇發作［17］。本研究納入的6 個癲癇相關X 連鎖基因均已通過外顯子檢測，確認其癲癇致病性，但是否存在其他遺傳調控機制參與尚不清楚。因此，本研究從DNA 甲基化角度，初步明確癲癇相關X 連鎖基因是否和顳葉癲癇表型相關，為顳葉癲癇病理機制研究提供新的突破口。

本研究系統評估了癲癇相關X連鎖基因CASK、CDKL5、IQSEC2、MECP2、PCDH19、WDR45 的DNA甲基化水平與顳葉癲癇表型的關系，發現這些基因的DNA 甲基化率在癲癇組和對照組間無統計學差異，提示上述X 連鎖基因在顳葉癲癇中很可能不受DNA 甲基化的表觀遺傳調控。進一步對不同基線特征的顳葉癲癇患者進行分析比較，發現CASK、CDKL5、IQSEC2、MECP2、PCDH19、WDR45 的DNA甲基化率在女性患者中均顯著降低；而且在健康對照人群中，這些基因的DNA 甲基化率也有類似表現。這提示上述X 連鎖基因DNA 甲基化與性別密切相關。已有研究顯示，X 連鎖基因CASK、CDKL5、IQSEC2、MECP2、PCDH19、WDR45 在顳葉癲癇患者和正常人群中均未表現出性別相關的表達差異［18-19］，因此認為，X 連鎖基因DNA 甲基化率在性別間的差異不會導致基因表達的差異，故而對疾病的表型應該無影響。

實際上，X 連鎖基因在兩性間存在拷貝數差異：男性X 染色體只有1 個拷貝，女性X 染色有2 個拷貝，故而相對于常染色體基因，X 連鎖基因具有獨特的調控機制，例如劑量補償和減數分裂性染色體沉默［20］，但是其具體機制尚未明了。本研究通過對顳葉癲癇患者和正常對照的亞組分析，推測女性患者X 連鎖基因相對較高的甲基化率，有助于女性患者X 染色體雙拷貝基因的代償性沉默，以維持其在兩性間相似的表達水平和生理功能，這為X 連鎖基因在兩性間的表達調控機制提供了新的線索。

綜上所述，X 連鎖基因在顳葉癲癇中很可能不受DNA 甲基化的表觀遺傳調控，但是X 連鎖基因DNA 甲基化率在女性患者和女性健康對照者中，分別較男性患者和男性健康對照者升高，這為DNA 甲基化參與女性X染色體沉默調控提供了線索。值得注意的是，細胞和組織的分化和功能實現與DNA 甲基化的調控密切相關，故而DNA 甲基化在一定程度上存在細胞和組織特異性［21］。而本研究基于外周血液樣本，缺乏腦組織樣本，相關結果未能在腦組織中驗證；且因基于單中心、小樣本，相關結果是否具有廣泛適用性尚待驗證。