MicroRNA與生精障礙的研究進展

孫文文，阿周存

（大理大學1.基礎醫學院，2.農學與生物科學學院，云南大理 671003）

精子發生是一個嚴格控制的、多步驟的過程，涉及眾多基因的表達調控。相關基因的表達調控異常會引起生精障礙。近年來大量研究表明，microRNA（miRNA）介導的轉錄后基因表達調控是生精過程中基因表達調控的一種重要方式，對睪丸發育和精子生成至關重要。因此，miRNA 在生精障礙中的作用受到人們的關注，成為生精障礙遺傳病因學研究的一個新的領域，具有廣闊的探索空間。

1 miRNA在生精過程中的調節

miRNA 是一類長度為20～25 個核苷酸的內源性非編碼RNA，參與轉錄后基因水平的表達調控。其通過與RNA 誘導的沉默復合體（miRISC）的結合與靶mRNA 的3′-UTRs 堿基配對形成雙鏈，造成mRNA 碎片化進而抑制靶基因翻譯表達。近年來，在人類和哺乳動物研究中發現一些與精子發生相關的miRNA 基因。這些miRNA 可以調節生精過程中相關靶基因的表達，實現對整個生精過程的調控。見圖1（引自HE等[1]）。

圖1 miRNA調節生精過程示意圖

1.1 miRNA在精原干細胞自我更新和分化過程中的作用機制

精原干細胞（spermatogonial stem cells, SSCs）是睪丸中最原始的精原細胞，其通過自我更新、增殖、分裂等環節最終形成精子細胞[2]。現在已經發現了幾個調節人類SSCs 細胞的miRNA 基因，這些miRNA能通過靶向特定基因，對SSCs 增殖和DNA 的合成起調控作用。其中，miR-663a和miR-31-5p是比較明確的兩個。miR-663a使NFIX基因沉默，提高Cyclin A2、Cyclin B1 及Cyclin E1 細胞周期調節因子的水平，促進人類SSCs 增殖和分化，同時抑制干細胞早期凋亡[3]。miR-31-5p具有與miR-663a相反的作用，miR-31-5p使JAZF1基因沉默，降低Cyclin A2 水平，進而降低SSCs 增殖和DNA 合成，并促進早期和晚期干細胞凋亡[4]。

除了在人類SSCs 中發現與生精相關的miRNA外，在動物模型研究中也發現了許多的與SSCs 細胞調控相關的miRNA。一些miRNA 通過影響不同的信號傳導通路參與SSCs的發育調控。例如，miR-486、miR-322及miR-224分別沉默靶基因MMP2、RASSF8及DMRT1，激活WNT/β-catenin 信號傳導通路，參與對SSCs 自我更新和分化的調控[5-7]；而miR-19b-3p作用于靶基因PLZF后激活Jak-Stat 信號傳導通路，并通過這一信號通路調控SSCs 增殖分化過程[8]。除上述miRNA 外，還有一些miRNA 明確的靶基因，并且都能調控小鼠SSCs 的自我更新，但其調控過程中具體涉及哪些信號通路仍需進一步研究。如miR-31、miR-100、miR-125a等[9-11]。此外，有研究[12]報道miR-21也能促進水牛SSCs 的分化，但其靶基因和調控機制尚不清楚。

上述在動物SSCs 發育調控中發揮作用的miRNA 與人類SSCs 的關系還有待進一步證實，但這些miRNA 的發現為闡明人類SSCs 發育調控相關的miRNA 提供了有價值的線索。

1.2 miRNA對減數分裂及減數分裂后的調節

miRNA 在減數分裂和減數分裂后的生精細胞中發揮著重要作用。許多miRNA 基因序列在X 染色體上串聯重復，形成多個獨立、具有選擇驅動性的miRNA 簇，導致哺乳動物X 染色體miRNA 基因密度高于常染色體[13]。在雄性哺乳動物減數分裂粗線期，X 和Y 染色體轉錄沉默的過程稱為減數分裂性染色體失活。減數分裂性染色體失活在哺乳動物中高度保守，對雄性動物正常生精功能是必須的[14]。研究表明，X 染色體上的miRNA（也稱為X 連鎖miRNA）多基因家族在男性生殖細胞中比其他類型的miRNA 具有更高的表達水平[15]。在減數分裂前期，性染色體基因通過減數分裂性染色體失活在精母細胞中發生表觀遺傳沉默。然而，通過基因重復擴增的X 連鎖miRNA 家族，卻可以避免被減數分裂性染色體失活沉默并繼續在精母細胞和精子細胞中表達。

為了闡明X 連鎖miRNA 的功能，OTA 等[16]使用CRISPR/Cas9 介導的基因組編輯系統敲除小鼠模型中連續位于X 染色體上的miR-741-3p、miR-871-3p、miR-465a-5p基因。雖然小鼠睪丸組織未發現異常，但miR-871-3p的缺失導致減數分裂在一些生精小管中停止。在培養的小鼠精原干細胞中，如果僅敲除表達最高的miR-741-3p，miR-465a-5p的表達會顯著上調并成為含量最豐富的miRNA，同時mRNA 的全基因組表達水平保持不變且小鼠的生精過程正常進行。這表明與生精相關的miRNA 家族成員之間存在功能補償，并且其靶向標志物之間存在強烈協同進化。

miR-34家族是第一個被證明為哺乳動物精子產生所必需的X 連鎖miRNA。缺乏miR-34家族成員的小鼠的減數分裂不能正常進行且精子出現缺陷[17]。miR-29簇也被證明在生殖細胞減數分裂期對mRNA 靶標進行抑制，不過其靶mRNA 與miR-34簇的靶mRNA 有很大不同[18]。miR-449和miR-34簇的沉默模式相似，能夠靶向多個共同mRNA。雖然miR-34或miR-449簇的缺失在雄性生殖細胞發育中都沒有表現出明顯的缺陷，但同時敲除這兩個基因會導致小鼠減數分裂異常，引起生精障礙[19]。這說明miR-34和miR-449簇之間存在功能冗余，兩者在雄性生精過程中不可或缺。

精子發生過程中所必需的過渡蛋白（TNP）和魚精蛋白（PRM）在減數分裂特定階段受到miRNA 轉錄后調控。miR-469簇以TNP2和PRM2為靶點在減數分裂起始階段高表達，抑制粗線期精母細胞和圓形精細胞中TNP 和PRM 蛋白的表達，使圓形精細胞生長停滯[20]。miR-122a能降解TNP2轉錄物，其過度表達使圓形精細胞發生凋亡，進而影響精子成熟[21]。此外，RAD51和HSF2基因也是減數分裂進程中的兩個重要基因，這兩個基因分別是miR-10a和miR-18的靶向標志物。miR-10a和miR-18的異常將導致上述這兩個靶基因表達水平改變，最終影響男性精子正常成熟[22-23]。

2 miRNA與生精障礙的關系

由于miRNA 在精子發生過程中具有重要作用，是精子生成所必需的，因此，miRNA 在男性生精障礙病因學中具有極大研究價值。目前，對miRNA 與生精障礙的關系已有了一些的研究和認識，主要集中在表達譜分析和作為特異性標志物的可行性等方面。

2.1 miRNA的表達譜研究

近年來，研究不育癥患者睪丸組織或精子中miRNA 的表達譜成為了解miRNA 在生精障礙中作用的重要方式和手段[24]。例如，在睪丸組織中發現梗阻性無精子癥患者與非梗阻性無精子癥患者之間精原細胞、粗線期精母細胞和圓形精子具有miRNA 的獨特表達譜。相應地，在患者的這3 種細胞中也發現一些miRNA 表達水平改變：精原細胞中有9 種miRNA 表達水平異常；粗線期精母細胞中有11 種miRNA 的表達水平異常；圓形精子細胞有10 種miRNA 表達水平異常[25]。分析這些miRNA 的差異性表達為進一步闡明生精障礙相關的miRNA提供了重要線索。表達譜的研究不只限于睪丸組織，在精液中也發現miRNA 表達譜的變化。例如，采用高通量測序技術分析弱精子癥病例和健康男性精液中的miRNA 圖譜，對比發現弱精子癥男性中有18 種miRNA 的表達水平發生改變[26]。提示這些miRNA 的改變可能與弱精子癥的發病有關。由于精液標本相對睪丸組織標本更容易獲取，生精障礙患者精液的miRNA 表達譜的研究為尋找生精障礙相關miRNA 提供了便利。

此外，隱睪癥引起的生精障礙也是男性不育的重要原因之一，但miRNA 與該疾病的關系目前尚不明確。miRNA 表達譜的研究為了解兩者的關系提供了新的探索思路。例如，分析隱睪癥患者睪丸組織的miRNA 表達譜，發現miR-299-5p、miR-206、miR-135a等多個miRNA 高表達，提示相關miRNA 的表達異常可能與隱睪癥發病有關。

總之，對生精障礙患者睪丸組織或精子細胞的miRNA 表達譜的分析為生精障礙遺傳病因學研究開辟了一個新的領域。

2.2 miRNA為生精障礙診斷的生物標志物

精液中的常規生化標志物，如酸性磷酸酶、檸檬酸、鋅、果糖和α-葡萄糖苷酶，可用于診斷梗阻性生精障礙和生殖腺的功能異常。而現在對于非梗阻性生精障礙引起的不育癥卻缺乏用于臨床檢驗的特異性生物標志物，因此，探索具有診斷和預測功能的非侵入分子性標志物顯得尤為重要。miRNA 以非常穩定的形式存在于體液中，且具有組織特異性表達譜、序列保守性、檢測擴增簡單等優點[27]。這些有利條件使其成為研究男性不育癥病因非侵入性生物標志物的理想候選者。

目前，已經有一些miRNA 被證實可作為潛在的生物標志物用于臨床。例如，miR-34b和miR-122與其他常規檢測相結合可以提高不同形式非梗阻性無精子癥的診斷準確性；多變量回歸分析證明miR-10b-3p和miR-34b-5p相較其他檢測標志物在非梗阻性無精子癥中具有更高的表達水平，兩者聯合使用診斷效能更高[28]。miR-I9b和LET-7a基因在少精子癥不育患者中的表達水平明顯高于正常個體。因此，miR-19b和LET-7a被認為是診斷少精子癥的良好分子生物標志物[29]。從目前的研究情況來看，miRNA 作為生物標志物在診斷生精障礙性疾病方面有很大的潛能，但其應用于臨床的條件還不完全成熟，還需要進一步的研究、篩選并優化。

2.3 miRNA的SNP與生精障礙的關系

單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphisms, SNP）是人類基因組中最豐富的DNA變異形式，研究表明miRNA 的SNP 與多種疾病的發生有關。miRNA 基因中的SNP 可通過影響前體miRNA 的轉錄、前體miRNA 的加工及miRNA 與mRNA 的結合調節靶基因的表達，進而參與疾病發生[30]。因此，分析生精相關的miRNA 的SNP 也成為了解miRNA 與生精障礙性疾病的關系的重要方法。許多研究證明，一些miRNA 的SNP 與生精障礙有關。通過生物信息學分析、病例對照研究和雙熒光素酶報告分析，發現miR-1302基因SNP 位點rs6631 會增加生精障礙的風險[31]。與MTHFR基因3′-UTR 結合的miR-34b的SNP 位點rs55763075 和miR-196a-2的SNPs 位點rs11614913 分別被證實是無精子癥的危險因素[32-33]。最近，又發現miR-34b/c基因的SNP 位點rs4938723 的多態性與少精癥相關，且SNP rs4938723 的CC 基因型可能增加少精癥的發病風險[34]。該研究結果為進一步闡明miRNA 在人類生精障礙中的作用提供有價值的資料。

由于生精相關的miRNA 的SNP 可能影響miRNA 的功能，引起生精過程相關靶基因表達調控出現異常，進而影響正常生精過程導致生精障礙。因此，miRNA 的SNP 也被認為是生精障礙臨床診斷的候選生物標志物。研究鑒定生精障礙相關的miRNA 的SNP 對生精障礙的臨床診斷具有重要意義。

3 miRNA在生精障礙領域的展望

miRNA 對精子發生中的基因調控是男性不育癥病因學研究的重大突破之一，意味著找到了除蛋白質之外的重要調控因子。miRNA 在不同生精階段和不同類型生精障礙性疾病的差異性表達使其具有極高的特異性和敏感性，在未來男性生精障礙性疾病的分子機制研究和臨床診斷與治療上具有很大的發展空間，有望取得突破性的研究成果。