姜黃素抑制肺癌細(xì)胞A549上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的機(jī)制研究

鄭爽，許林暉，夏書(shū)月

（沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院附屬中心醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，遼寧沈陽(yáng) 110075）

肺癌是世界范圍內(nèi)發(fā)病率和病死率最高的惡性腫瘤，多數(shù)肺癌患者在就診時(shí)就已經(jīng)發(fā)生遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移，喪失了手術(shù)機(jī)會(huì)[1]，不僅如此，肺癌術(shù)后的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移也是影響患者生存率的重要因素。因此，找尋有效抑制肺癌侵襲、轉(zhuǎn)移的藥物和新的治療靶點(diǎn)是目前亟待解決的問(wèn)題。

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化是一個(gè)動(dòng)態(tài)細(xì)胞過(guò)程，細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程中細(xì)胞骨架發(fā)生重塑，細(xì)胞間接觸蛋白如E-cadherin 丟失或減弱，上皮特性減弱，同時(shí)細(xì)胞獲得間質(zhì)特征，如Vimentin、N-cadherin、Snail等標(biāo)志物表達(dá)升高，最終導(dǎo)致細(xì)胞的侵襲和遷移能力增強(qiáng)[2-3]。因此，以阻止上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化發(fā)生為靶點(diǎn)，抑制腫瘤侵襲是目前關(guān)注的熱點(diǎn)[4]。姜黃素、雷公藤紅素、青蒿素、雷公藤甲素、辣椒素在2007年被《Cell》雜志列為最有可能被開(kāi)發(fā)成為現(xiàn)代藥物的5 種傳統(tǒng)天然藥用化合物[5]，對(duì)治療腫瘤具有重大的意義。姜黃素是從中藥材中提取的一種化學(xué)成分，是植物中稀有的二酮類(lèi)化合物。姜黃素可抑制腫瘤細(xì)胞增殖，且對(duì)正常細(xì)胞無(wú)明顯的細(xì)胞毒效應(yīng)，因而在抗腫瘤治療中得到廣泛的研究與關(guān)注[6]。研究證實(shí)，姜黃素不僅具有抗腫瘤作用，同時(shí)還可以抑制腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[7-8]。目前研究表明，姜黃素有多個(gè)治療靶點(diǎn)，包括多種基因、生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)錄因子、信號(hào)傳導(dǎo)通道等。隨著對(duì)姜黃素認(rèn)識(shí)的深入，人們發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non-coding RNA,lncRNA）同樣也是姜黃素下游重要的作用靶點(diǎn)[9-10]。

lncRNA 是長(zhǎng)度＞200 個(gè)核苷酸的非編碼RNA，可通過(guò)基因轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后、翻譯、翻譯后水平調(diào)控基因表達(dá)，在多種生理學(xué)（細(xì)胞增殖、表觀調(diào)控、基因組印記、X 染色體失活等）和病理學(xué)（癌癥、神經(jīng)退行性疾病、免疫功能障礙、心血管及代謝性疾病等）過(guò)程中發(fā)揮重要作用[11]。近年來(lái)研究者發(fā)現(xiàn)，lncRNA 在腫瘤治療過(guò)程中同樣發(fā)揮重要的調(diào)控作用[12]。許多l(xiāng)ncRNA 的異常表達(dá)是導(dǎo)致腫瘤治療失敗的重要原因[13]。HOTAIR 是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)具有反式作用的lncRNA。研究證實(shí)，HOTAIR 是上皮源性惡性腫瘤特征性分子事件，在多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，以及預(yù)測(cè)預(yù)后上發(fā)揮重要的作用。那么，HOTAIR 是否介導(dǎo)姜黃素在肺癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程值得關(guān)注。

本研究檢測(cè)HOTAIR、E-cadherin、N-cadherin 及Snail mRNA 和蛋白相對(duì)表達(dá)量及l(fā)ncRNA 的表達(dá)，找尋介導(dǎo)姜黃素發(fā)揮作用的具體lncRNA，并進(jìn)一步探討這一過(guò)程發(fā)生的具體機(jī)制，為進(jìn)一步明確姜黃素在肺癌治療過(guò)程中發(fā)揮作用的機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

人肺癌細(xì)胞株A549 購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所，細(xì)胞在含100 mL/L 胎牛血清（FBS）的1640 培養(yǎng)基中，于37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。細(xì)胞每天換液處理，待細(xì)胞密度生長(zhǎng)至80%進(jìn)行傳代。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 肺癌組織標(biāo)本

選取2013年5月—2015年6月于沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院附屬中心醫(yī)院行肺癌切除的患者93 例?；颊咝g(shù)前均未進(jìn)行放化療。癌旁組織標(biāo)本（距離腫瘤＞2 cm）作為正常組織對(duì)照。根據(jù)患者病理結(jié)果，RT-PCR 分析HOTAIR 的表達(dá)，按照表達(dá)量分為高表達(dá)和低表達(dá)，分析HOTAIR 表達(dá)與年齡、性別、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM 分期之間的關(guān)系。

1.3 方法

1.3.1 CCK-8法檢測(cè)A549細(xì)胞活性取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，經(jīng)無(wú)血清培養(yǎng)基饑餓處理24 h 后，胰酶消化細(xì)胞并將細(xì)胞制備成細(xì)胞懸液加入到96 孔培養(yǎng)板中，設(shè)立6 個(gè)復(fù)孔；加入0.0 μmol/L、1.0 μmol/L、2.5 μmol/L、5.0 μmol/L、10.0 μmol/L、20.0 μmol/L、25.0 μmol/L 和50.0 μmol/L 濃度的姜黃素，對(duì)照組加入相同體積磷酸鹽緩沖液（PBS），待細(xì)胞生長(zhǎng)到特定時(shí)間后每孔加入10 μL CCK-8 溶液，于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育2 h；酶標(biāo)儀450 nm 處檢測(cè)OD 值，以O(shè)D 值作為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.3.2 Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)A549 細(xì)胞遷移、侵襲能力遷移實(shí)驗(yàn)：Tranwell 小室上室內(nèi)鋪入姜黃素誘導(dǎo)后的50 000 個(gè)細(xì)胞，以未加藥組為對(duì)照組，下室中加入600 μL 含10% FBS 的培養(yǎng)基，小室置于24 孔板中，于孵箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)24 h。4%多聚甲醛固定細(xì)胞，0.1%結(jié)晶紫染色，顯微鏡下觀察結(jié)果并拍照。每組設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔，所有實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3 次。侵襲實(shí)驗(yàn)：Matrigel 膠4℃冰箱中過(guò)夜充分溶解后，與培養(yǎng)基按照1∶8 稀釋?zhuān)A(yù)冷的槍頭吸取100 μL Matrigel 膠鋪于上室，將Transwell 小室置于孵箱內(nèi)90 min 后取出。其余分組以及步驟同遷移實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 Western blotting 檢測(cè)E-cadherin、N-cadherin、Snail 蛋白的相對(duì)表達(dá)量細(xì)胞刮刀收集對(duì)照組及姜黃素誘導(dǎo)組細(xì)胞，加入RIPA 細(xì)胞裂解液，提取各組細(xì)胞蛋白。BCA 法檢測(cè)各組細(xì)胞蛋白濃度。將樣品調(diào)成相同濃度后加入Running Buffer，100℃變性5 min。取50 μg 蛋白樣品在10%分離膠中電泳，電泳結(jié)束后采用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)印至聚偏二氟乙烯膜（PVDF）上，轉(zhuǎn)膜條件：恒壓50 V，2 h。5%脫脂牛奶室溫下封閉1 h 并孵育相應(yīng)抗體，4℃過(guò)夜。三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液（TBST）清洗干凈后加入辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗，ECL 發(fā)光，以GAPDH 為內(nèi)參。通過(guò)Image J 對(duì)條帶進(jìn)行灰度值分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3.4 qRT-PCR 檢測(cè)HOTAIR、E-cadherin、Ncadherin、Snail mRNA 的相對(duì)表達(dá)量采用1 mL Trizol 試劑提取肺癌組織、癌旁正常組織、對(duì)照組細(xì)胞及姜黃素誘導(dǎo)組細(xì)胞總RNA，采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA 濃度，取1 μg 總RNA 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，逆轉(zhuǎn)錄cDNA 條件：42℃預(yù)變性15 min，70℃變性15 min，1 個(gè)循環(huán)。引物通過(guò)Primer 3 在線設(shè)計(jì)，經(jīng)Blast 檢測(cè)評(píng)分后由上海生工生物工程股份有限公司合成。qRT-PCR 按照20 μL 反應(yīng)體系（cDNA 2 μL，GoTap qPCR Master Mix，2× 10 μL，正反向引物各0.4 μL，Nuclease-Free Water 7.2 μL），反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 min；95℃變性15 s，60℃退火1 min，共40 個(gè)循環(huán)，記錄每個(gè)樣品的Ct 值，按照2-ΔΔCt計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。每個(gè)樣品設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔，每個(gè)實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3 次。引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

1.3.5 姜黃素處理前后的肺癌細(xì)胞A549 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序姜黃素處理24 h 后提取細(xì)胞總RNA，對(duì)提取的RNA進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)，采用Illumina HiSeq 2000 高通量測(cè)序平臺(tái)對(duì)濃度、純度和完整性符合測(cè)序質(zhì)量要求的樣本進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。構(gòu)建文庫(kù)，通過(guò)應(yīng)用Agilent 2100 Bioanalyzer 檢測(cè)總RNA 濃度、RIN 值及28S/18S片段大小。采用邊合成邊測(cè)序技術(shù)，利用BGISEQ-500 平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序，得到100 bp 的測(cè)序讀長(zhǎng)。篩選通過(guò)測(cè)序獲得的原始數(shù)據(jù)中低質(zhì)量、接頭污染及未知堿基N 含量過(guò)高的reads，獲得有效reads，即clean reads，以保證結(jié)果的可靠性。本部分實(shí)驗(yàn)交由北京諾禾致源公司完成。

1.3.6 細(xì)胞轉(zhuǎn)染HOTAIR 過(guò)表達(dá)質(zhì)粒及陰性對(duì)照質(zhì)粒購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因科技有限公司。細(xì)胞傳代后，待細(xì)胞融合度達(dá)到約50% 左右，使用Lipofectamine 3000 轉(zhuǎn)染試劑盒進(jìn)行轉(zhuǎn)染。根據(jù)轉(zhuǎn)染說(shuō)明書(shū)首先取2 支2.5 mL 的無(wú)菌EP 管，隨后在管中加入250 μL 的Opti-MEM 培養(yǎng)基，2 支EP 管分別加入5 μL Lipofectamine 3000 和P3000 轉(zhuǎn)染試劑，Lipofectamine 3000 的EP 管中加入5 μL 的質(zhì)粒，靜置3 min，將Lipofectamine 3000 與P3000 試劑混合，室溫靜置3 min，最后加入培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)6 h 后換液，轉(zhuǎn)染后24 h 收集細(xì)胞，提取總RNA，驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率。按照同樣步驟轉(zhuǎn)染后進(jìn)行Western blotting、Transwell及CCK-8 實(shí)驗(yàn)，步驟同前。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用t檢驗(yàn)或方差分析，進(jìn)一步兩兩比較用秩和檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例（%）表示，比較用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 姜黃素抑制肺癌細(xì)胞增殖

CCK-8 實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，姜黃素誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞A549 24 h 后，不同濃度組肺癌細(xì)胞A549 的OD 值比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），隨著姜黃素濃度的升高，OD 值降低。25.0 μmol/L 姜黃素能有效抑制A549 細(xì)胞增殖，故將此濃度選做本實(shí)驗(yàn)使用濃度。見(jiàn)表2和圖1。

圖1 姜黃素抑制肺癌細(xì)胞A549增殖 （±s）

表2 不同濃度肺癌細(xì)胞A549 OD值比較 （±s）

表2 不同濃度肺癌細(xì)胞A549 OD值比較 （±s）

組別姜黃素0.0 μmol/L組姜黃素1.0 μmol/L組姜黃素2.5 μmol/L組姜黃素5.0 μmol/L組姜黃素10.0 μmol/L組姜黃素20.0 μmol/L組姜黃素25.0 μmol/L組姜黃素50.0 μmol/L組F 值P 值OD值0.46±0.06 0.45±0.05 0.41±0.02 0.38±0.03 0.33±0.04 0.19±0.01 0.11±0.01 0.10±0.01 6.514 0.000

2.2 姜黃素抑制肺癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移

Transwell 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，姜黃素誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞A549 24 h 后，姜黃素誘導(dǎo)組抑制肺癌細(xì)胞A549 的侵襲、遷移能力與對(duì)照組比較：姜黃素誘導(dǎo)組細(xì)胞侵襲數(shù)（208.66±13.61）個(gè)，對(duì)照組（357.33±19.01）個(gè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=11.01，P=0.0004）。姜黃素誘導(dǎo)組細(xì)胞遷移數(shù)（223.10±8.88）個(gè)，對(duì)照組（411.66±16.80）個(gè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=17.190，P=0.000）。見(jiàn)圖2。

圖2 姜黃素抑制肺癌細(xì)胞A549的侵襲與遷移

2.3 姜黃素抑制肺癌細(xì)胞A549上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化

qRT-PCR 和Western blotting 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，姜黃素誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞A549 后，姜黃素誘導(dǎo)組的E-cadherin 、N-cadherin 、Snail mRNA 和蛋白相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），姜黃素誘導(dǎo)組N-cadherin、Snail mRNA 和蛋白相對(duì)表達(dá)量升高，E-cadherin mRNA 和蛋白相對(duì)表達(dá)量下降。見(jiàn)表3、4 及圖3。

圖3 姜黃素抑制肺癌細(xì)胞A549上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化

表3 兩組肺癌細(xì)胞A549中E-cadherin、N-cadherin、Snail mRNA 相對(duì)表達(dá)量比較 （±s）

表3 兩組肺癌細(xì)胞A549中E-cadherin、N-cadherin、Snail mRNA 相對(duì)表達(dá)量比較 （±s）

組別對(duì)照組姜黃素誘導(dǎo)組t 值P 值E-cadherin mRNA 0.99±0.12 0.33±0.14 36.892 0.007 N-cadherin mRNA 1.03±0.11 2.50±0.10 10.911 0.008 Snail mRNA 0.98±0.13 2.32±0.10 10.350 0.009

表4 兩組肺癌細(xì)胞A549中E-cadherin、N-cadherin、Snail蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 （±s）

表4 兩組肺癌細(xì)胞A549中E-cadherin、N-cadherin、Snail蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 （±s）

組別對(duì)照組姜黃素誘導(dǎo)組t 值P 值E-cadherin蛋白1.02±0.02 0.35±0.03 14.713 0.004 N-cadherin蛋白0.48±0.03 1.27±0.02 51.082 0.000 Snail蛋白0.38±0.04 0.98±0.05 10.355 0.009

2.4 HOTAIR 在肺癌組織中的表達(dá)及其與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系

癌旁正常組HOTAIR mRNA 的相對(duì)表達(dá)量（0.05±0.06）與肺癌組HOTAIR mRNA 的相對(duì)表達(dá)量（0.14±0.10）比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=7.495，P=0.000），肺癌組高于癌旁正常組。通過(guò)分析HOTAIR 與肺癌患者臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)HOTAIR 的表達(dá)與患者的TNM 分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，與患者年齡、性別無(wú)關(guān)。 結(jié)果提示HOTAIR 參與了肺癌的進(jìn)展。見(jiàn)表5。

2.5 姜黃素抑制lncRNA HOTAIR表達(dá)

qRT-PCR 結(jié)果證實(shí)，姜黃素抑制肺癌細(xì)胞lncRNA HOTAIR 的表達(dá)最為明顯（見(jiàn)表6）。測(cè)序結(jié)果顯示，姜黃素對(duì)多個(gè)lncRNA 表達(dá)均有調(diào)控作用（見(jiàn)圖4）。

圖4 姜黃素抑制lncRNA HOTAIR的表達(dá)

表6 兩組A549細(xì)胞中l(wèi)ncRNA相對(duì)表達(dá)量比較（±s）

表6 兩組A549細(xì)胞中l(wèi)ncRNA相對(duì)表達(dá)量比較（±s）

組別對(duì)照組姜黃素誘導(dǎo)組t 值P 值HOTAIR 1.00±0.03 0.23±0.09 42.780 0.000 TUG1 1.03±0.01 0.42±0.03 33.180 0.000 LINC01125 0.98±0.02 0.53±0.10 24.130 0.000 LINC00662 1.02±0.03 0.89±0.12 4.660 0.198組別對(duì)照組姜黃素誘導(dǎo)組t 值P 值H19 0.99±0.03 0.44±0.1 29.070 0.000 NBR2 1.04±0.04 0.93±0.13 1.370 0.999 LINC00960 0.97±0.02 0.68±0.12 16.730 0.000組別對(duì)照組姜黃素誘導(dǎo)組t 值P 值GAS5 0.96±0.03 0.52±0.13 23.860 0.000 MEG3 1.05±0.02 1.39±0.12 22.480 0.000 LINC00475 1.01±0.02 0.89±0.11 5.210 0.099

2.6 姜黃素通過(guò)HOTAIR 抑制肺癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換

為確定HOTAIR 是參與姜黃素調(diào)控肺癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的下游效應(yīng)因子，本研究對(duì)肺癌細(xì)胞A549 轉(zhuǎn)染HOTAIR 質(zhì)粒再給予姜黃素干預(yù)。結(jié)果證實(shí)姜黃素抑制肺癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的效果與抑制增殖被逆轉(zhuǎn)。對(duì)照組、姜黃素誘導(dǎo)組、姜黃素誘導(dǎo)+HOTAIR 過(guò)表達(dá)組A549 細(xì)胞OD值分別為（0.57±0.06）、（0.14±0.05）和（0.53±0.07），3 組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=101.300，P=0.000）。這一結(jié)果提示姜黃素抑制肺癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化是通過(guò)lncRNA HOTAIR 實(shí)現(xiàn)的。見(jiàn)圖5。

圖5 姜黃素通過(guò)HOTAIR抑制肺癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化

3 討論

肺癌是世界范圍內(nèi)發(fā)病率和病死率最高的惡性腫瘤，目前肺癌的治療水平不斷提高，但患者的病死率仍居高不下，其中一個(gè)重要的因素是多數(shù)患者在晚期發(fā)生遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移，使得多種治療手段無(wú)法取得有效的治療效果[14]。因此，抑制肺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移是提高患者生存率的有效方法之一。

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化是在病理?xiàng)l件或生理狀態(tài)下，細(xì)胞上皮特性減弱，同時(shí)獲得間質(zhì)特性。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化現(xiàn)象存在于胚胎發(fā)育過(guò)程中，研究證實(shí)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化是胚胎成熟必不可少的過(guò)程[14]。隨著對(duì)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化認(rèn)識(shí)的深入，越來(lái)越多的證據(jù)顯示，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程中同樣發(fā)揮不可或缺的作用[15-16]。目前，以上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程為靶點(diǎn)，抑制腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移已經(jīng)成為腫瘤治療研究的重要方向。但是，在治療過(guò)程中所使用的傳統(tǒng)化療藥物常常伴隨不良反應(yīng)，而且長(zhǎng)期使用導(dǎo)致耐藥的發(fā)生也是臨床常見(jiàn)的問(wèn)題[17]。由于這些限制，國(guó)內(nèi)外抗癌藥物的研發(fā)逐漸將目光轉(zhuǎn)向天然植物，中藥治療成為腫瘤治療領(lǐng)域新興的熱點(diǎn)。姜黃素是在植物中提取的化學(xué)成分，具有較低的毒副作用，尤其是姜黃素對(duì)腫瘤細(xì)胞具有抑制作用，而對(duì)正常細(xì)胞無(wú)明顯的細(xì)胞毒性作用。既往研究證實(shí)，姜黃素在多種腫瘤中都體現(xiàn)出良好的抗腫瘤效果[18]。姜黃素被認(rèn)為是最有可能被開(kāi)發(fā)成為現(xiàn)代天然藥用化合物之一[19]。姜黃素在多種腫瘤中不僅具有抑制腫瘤增殖、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用，同時(shí)具有抑制腫瘤向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的作用。本研究CCK-8 實(shí)驗(yàn)明確姜黃素對(duì)肺癌細(xì)胞的抑制作用，同時(shí)發(fā)現(xiàn)25 μmol/L 濃度的姜黃素能有效抑制細(xì)胞的增殖，故將25 μmol/L 選做本實(shí)驗(yàn)的使用濃度。本研究通過(guò)Transwell 實(shí)驗(yàn)證實(shí)姜黃素能夠抑制肺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，Western blotting 檢測(cè)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化標(biāo)志蛋白發(fā)現(xiàn)，姜黃素在抑制肺癌細(xì)胞侵襲和遷移的同時(shí)抑制了上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的發(fā)生。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化在腫瘤發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移的早期有重要的意義，腫瘤細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的發(fā)生使得腫瘤細(xì)胞遷移能力增強(qiáng)，更容易發(fā)生腫瘤早期轉(zhuǎn)移[20]。通過(guò)姜黃素治療，肺癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力受到抑制，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化被逆轉(zhuǎn)，說(shuō)明姜黃素不僅對(duì)肺癌細(xì)胞快速增殖有抑制作用，同時(shí)對(duì)肺癌細(xì)胞的侵襲和遷移也有明顯抑制作用。既往研究證實(shí)，姜黃素對(duì)腫瘤發(fā)揮抑制作用的機(jī)制，不僅有經(jīng)典通路的參與，同時(shí)lncRNA 的表達(dá)改變也是姜黃素發(fā)揮作用的重要機(jī)制[21]。lncRNA 不編碼蛋白，在體內(nèi)的病理生理過(guò)程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[22-23]。本研究結(jié)果證實(shí)肺癌患者組織中HOTAIR 的表達(dá)顯著升高，HOTAIR 的表達(dá)與患者的TNM 分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，與患者年齡、性別無(wú)關(guān)。本研究測(cè)序發(fā)現(xiàn)姜黃素誘導(dǎo)后肺癌細(xì)胞中的lncRNAs 改變顯著，尤其是lncRNA HOTAIR。通過(guò)qRT-PCR 進(jìn)一步驗(yàn)證了姜黃素對(duì)lncRNA HOTAIR 表達(dá)調(diào)控最為明顯。HOTAIR是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)具有反式作用的lncRNA。人類(lèi)HOTAIR 在染色體12q13 區(qū)域，由5 個(gè)短外顯子和1 個(gè)長(zhǎng)外顯子共同組成。研究證實(shí)[24]，HOTAIR 在腫瘤原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移灶的表達(dá)較正常組織高200～2 000 倍，提示HOTAIR 在腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。本研究中發(fā)現(xiàn)姜黃素抑制HOTAIR 的表達(dá)，提示姜黃素抑制肺癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移是通過(guò)HOTAIR 實(shí)現(xiàn)的。進(jìn)一步在細(xì)胞中過(guò)表達(dá)HOTAIR 后再給予姜黃素，姜黃素對(duì)肺癌細(xì)胞的抑制作用被逆轉(zhuǎn)，證實(shí)姜黃素抑制肺癌細(xì)胞增殖，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化是通過(guò)HOTAIR 實(shí)現(xiàn)的。這些結(jié)果提示HOTAIR 參與了肺癌的進(jìn)展。本研究結(jié)果與LIU等[25]的研究結(jié)果一致。

綜上所述，本研究證實(shí)姜黃素不僅能夠抑制肺癌細(xì)胞增殖，還能顯著抑制侵襲和轉(zhuǎn)移，以及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的發(fā)生。同時(shí)本研究還證實(shí)姜黃素抑制肺癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化是通過(guò)lncRNA HOTAIR 實(shí)現(xiàn)的。