HPLC法同時測定健脾補(bǔ)血片中黨參炔苷、丁香苷、去氫土莫酸和茯苓酸的含量

★ 張小折 葉曉婭 薛曉會（平頂山市食品藥品檢驗所 河南 平頂山 467000）

健脾補(bǔ)血片具有補(bǔ)血益氣、健脾和胃、消積的作用，用于脾虛血少所致的面黃肌瘦、食少體倦等癥。其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅制定了顯微鑒別和理化鑒別［1］，未建立定量檢測項。該制劑組方中藥材成分繁多，僅以一個或兩個指標(biāo)性成分、單一波長進(jìn)行質(zhì)量控制不能全面科學(xué)地反映其內(nèi)在產(chǎn)品質(zhì)量，建立多指標(biāo)成分控制模式已經(jīng)成為中藥質(zhì)量研究的重要發(fā)展方向。健脾補(bǔ)血片由黨參、茯苓、神曲茶、皂礬、炒黑豆、白術(shù)、陳皮和甘草組方而成，方中君藥黨參健脾益肺、養(yǎng)血生津；臣藥茯苓健脾寧心、利水滲濕，神曲茶健胃消食；佐藥包括健脾益氣、燥濕利水的白術(shù)，養(yǎng)血補(bǔ)血的黑豆，燥濕化痰、止血補(bǔ)血、解毒斂瘡的皂礬和理氣健脾、燥濕化痰的陳皮；使藥甘草調(diào)和諸藥、補(bǔ)脾益氣。為全面綜合地評價健脾補(bǔ)血片的產(chǎn)品質(zhì)量，本研究選取君藥黨參、臣藥茯苓和神曲茶為研究對象，分析其所含的活性成分或代表性成分，采用HPLC雙波長梯度洗脫法對健脾補(bǔ)血片方中黨參中的黨參炔苷和丁香苷、茯苓中的去氫土莫酸和茯苓酸4種成分含量進(jìn)行同時測定，以期為全面綜合評價健脾補(bǔ)血片內(nèi)在產(chǎn)品質(zhì)量和提升其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供科學(xué)的實(shí)驗基礎(chǔ)。

1 材料

Shimadzu LC-20A型高效液相色譜儀（日本島津公司）；Waters Symmetry C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；MS205DU型十萬分之一分析天平（梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司）；KQ-250E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；丁香苷對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：111574-201605）；黨參炔苷和去氫土莫酸對照品（成都普瑞法科技開發(fā)有限公司，批號：PRF8092221和PRF9042427）；茯苓酸對照品（成都普思生物科技股份有限公司，批號：PS010073）；健脾補(bǔ)血片（廣州白云山和記黃埔中藥有限公司，批號：C2D001、D3E001、E2D001）；所用試劑均為色譜試劑，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 混合對照品溶液的制備

取黨參炔苷、丁香苷、去氫土莫酸和茯苓酸對照品各適量，精密稱定，用甲醇溶解并制成每1 mL含1.252、0.116、0.322、0.378 mg的混合對照品貯備液；精密吸取混合對照品貯備液2.5 mL，至50 mL量瓶，用甲醇定容制成含黨參炔苷0.062 6 mg/mL、丁香苷0.005 8 mg/mL、去氫土莫酸0.016 1 mg/mL和茯苓酸0.018 9 mg/mL的混合對照品溶液，即得。

2.2 供試品溶液的制備

取健脾補(bǔ)血片適量，除去包衣后研細(xì)，取約2.0 g，精密稱定，置25 mL量瓶中，加甲醇約20 mL，超聲處理30 min，放冷后用甲醇定容至刻度，過濾得到健脾補(bǔ)血片供試品溶液。

2.3 陰性樣品溶液的制備

健脾補(bǔ)血片由黨參、茯苓、神曲茶、皂礬、炒黑豆、白術(shù)、陳皮和甘草組方而來，其中神曲茶由茯苓、麥芽、炒六神曲、炒山楂、廣藿香、醋制香附、陳皮、炒蒼術(shù)、紫蘇葉、檳榔、桔梗、 姜制厚樸、白芷、 姜半夏、砂仁 、豆蔻和甘草加工而成，按質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)WS3-B-2018-95中健脾補(bǔ)血片的工藝處方，分別制備不含黨參、不含茯苓及不含神曲茶的陰性樣品，按照“2.2”項下步驟制成陰性樣品溶液。

2.4 色譜條件

色譜柱：Waters Symmetry C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱溫：30 ℃；流動相：乙腈（A）-0.05%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0~12.0 min，15.0%A；12.0~18.0 min，15.0% → 46.0%A；18.0~39.0 min，46.0%→81.0%A；39.0~50.0 min，81.0%→15.0%A），流速為1.0 mL/min；檢測波長：266 nm（0~18.0 min檢測黨參炔苷和丁香苷）［2-5］、210 nm（18.0~50.0 min檢測去氫土莫酸和茯苓酸）［6-9］；進(jìn)樣量：10 μL。

2.5 方法學(xué)驗證

2.5.1 專屬性試驗精密吸取“2.1~2.3”項下各溶液10 μL，依次注入高效液相色譜儀，依法檢測，結(jié)果色譜圖中主成分黨參炔苷、丁香苷、去氫土莫酸和茯苓酸與相鄰色譜峰均能完全分離，且分離度均>1.5，陰性樣品在健脾補(bǔ)血片中4個主成分相同保留時間處無色譜峰出現(xiàn)。見圖1。

圖1 各樣品HPLC圖

2.5.2 線性關(guān)系考察分別精密吸取“2.1”項下 混合對照品貯備液0.1、0.2、0.5、1.0、1.5、2.0mL，置20 mL量瓶中，用甲醇制成6個系列質(zhì)量濃度的混合對照品溶液，各精密吸取10 μL，依法進(jìn)樣檢測，以黨參炔苷、丁香苷、去氫土莫酸和茯苓酸的峰面積為縱坐標(biāo)（Y），主成分相應(yīng)質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），進(jìn)行線性回歸計算。見表1。

表1 線性關(guān)系考察結(jié)果

2.5.3 進(jìn)樣精密度試驗精密吸取“2.1”項下混合對照品溶液10 μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，得到黨參炔苷、丁香苷、去氫土莫酸和茯苓酸色譜峰峰面積的RSD分別為0.52%、1.16%、1.01%和0.95%。

2.5.4 重復(fù)性試驗取健脾補(bǔ)血片樣品（批號：C2D001）6份，按“2.2”項下步驟制備供試品溶液，依法進(jìn)樣測定并計算，得到黨參炔苷、丁香苷、去氫土莫酸和茯苓酸含量的RSD分別為1.20%、1.87%、1.79%和1.63%。

2.5.5 供試品溶液穩(wěn)定性考察試驗取健脾補(bǔ)血片同一份供試品溶液（批號：C2D001），于溶液制備后0、2、6、12、18、24 h進(jìn)樣檢測，共測定6次，得到黨參炔苷、丁香苷、去氫土莫酸和茯苓酸峰面積的RSD分別為0.57%、1.29%、1.08%和0.87%，結(jié)果表明健脾補(bǔ)血片供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.6 加樣回收率試驗取已知主成分含量的健脾補(bǔ)血片（批號：C2D001）9份，除去包衣后研細(xì)，每份約1.0 g，精密稱定后隨機(jī)分成3份，每份加入相同量的混合對照品溶液（黨參炔苷、丁香苷、去氫土莫酸和茯苓酸的質(zhì)量濃度分別為0.976、0.058、0.164和0.206 mg/mL），加入量分別為0.5 mL、1.0 mL和1.5 mL，按“2.2”項下步驟制備加樣供試品溶液。在上述色譜條件下進(jìn)行檢測并計算黨參炔苷、丁香苷、去氫土莫酸和茯苓酸的平均加樣回收率及RSD。見表2。

表2 健脾補(bǔ)血片各成分加樣回收試驗結(jié)果（n=9）

2.6 含量測定

分別取健脾補(bǔ)血片樣品3批，按照“2.2”項下步驟制備供試品溶液，在上述色譜條件下進(jìn)樣檢測，采用外標(biāo)法計算黨參炔苷、丁香苷、去氫土莫酸和茯苓酸的含量。見表3。

表3 樣品含量測定結(jié)果（n=3） mg/片

3 討論

3.1 供試品提取方法的選擇

為保證健脾補(bǔ)血片中黨參炔苷、丁香苷、去氫土莫酸和茯苓酸的綜合提取率，本實(shí)驗考察了提取方式（超聲提取、加熱回流提取）、提取溶劑（甲醇［2-8］、70% 甲醇［9］）及提取時間（20、30、40、60 min）對4個主成分提取率的影響，結(jié)果70%甲醇提取出較多的水溶性雜質(zhì)，干擾檢測。最終選擇健脾補(bǔ)血片中黨參炔苷、丁香苷、去氫土莫酸和茯苓酸的提取方法為甲醇超聲提取30 min。

3.2 流動相的選擇

因去氫土莫酸和茯苓酸在低波長210 nm附近吸收較為明顯，本實(shí)驗選擇乙腈作為有機(jī)相，對乙腈 - 水［2-3,5］、乙腈 -0.1% 甲酸［4］、乙腈 -0.1% 磷酸［6］和乙腈-0.05%磷酸［7-9］四個流動相體系進(jìn)行考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)采用乙腈-0.05%磷酸系統(tǒng)時，基線較為平穩(wěn)，分離效果較好。為進(jìn)一步完善檢測效果，又對有機(jī)相和水相比例進(jìn)行了摸索，最終確定按“2.4”項下方法測定健脾補(bǔ)血片中黨參炔苷、丁香苷、去氫土莫酸和茯苓酸。

3.3 色譜柱的選擇

本實(shí)驗對液相色譜柱Waters Symmetry C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Agilent TC-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）和 Phenomenex Luna-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）進(jìn)行了考察，發(fā)現(xiàn)Waters Symmetry C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）能滿足健脾補(bǔ)血片中黨參炔苷、丁香苷、去氫土莫酸和茯苓酸的檢測，主成分色譜峰峰形對稱性好，分離效果好，雜質(zhì)數(shù)量適中，檢測用時合適。

本文采用HPLC雙波長梯度洗脫法建立了健脾補(bǔ)血片多指標(biāo)成分質(zhì)量控制模式，為健脾補(bǔ)血片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升和全面綜合評價其產(chǎn)品質(zhì)量提供參考依據(jù)。