華山新麥草2Ns染色體SCAR標記的開發

呂博雅，張珍悅，趙 李，李曉萍，李家創，白宇皓，刁慧珊，劉 洋，楊群慧，劉淑會，武 軍，陳新宏

(1.西北農林科技大學農學院/陜西省植物遺傳工程育種重點實驗室，陜西楊凌 712100;2.陜西省興平市種子管理站，陜西興平 713100)

小麥是世界上最重要的糧食作物之一，加快小麥育種進程，提高小麥產量、品質和抗逆性仍是小麥育種工作者的主要目標。但是，小麥遺傳變異范圍較窄、遺傳多樣性降低等因素阻礙了小麥育種的發展。利用遠緣雜交技術可以將優良基因導入普通小麥，豐富小麥遺傳多樣性。華山新麥草(Keng)屬于禾本科小麥族新麥草屬，是中國秦嶺山脈華山地區特有的小麥近緣野生種。華山新麥草具有早熟、多分蘗、多小穗、抗逆(抗旱、耐鹽堿、耐瘠薄)、抗病(抗條銹病、白粉病和全蝕病)等優良性狀，是小麥遺傳改良的重要基因源。

為了利用華山新麥草中的優良性狀，陳漱陽等在20世紀80年代開始了華山新麥草與普通小麥的遠緣雜交，并獲得了一批小麥-華山新麥草衍生后代。之后，傅 杰等、武 軍等和Zhao等等也創造出了一系列的小麥-華山新麥草異附加系、異代換系和易位系。本課題組前期通過回交和自交，獲得了一套農藝性狀優良、抗病性強的小麥-華山新麥草全套(1Ns～7Ns)二體附加系。與此同時，研究者們還建立了鑒定和檢測小麥-華山新麥草后代外源染色體或基因的方法，這些方法包括生化鑒定(同工酶、種子貯藏蛋白分析)，細胞學鑒定(C-分帶、基因組原位雜交、熒光原位雜交)等。但遠緣雜交后代穩定性差，分離復雜且數量龐大，以上方法成本高且耗時長，限制了華山新麥草在小麥遺傳育種中的應用。而RAPD、EST-SSR、EST-STS和SCAR標記，成本相對較低，便于高通量分析，可有效地確定小麥背景中異源染色體的同源關系。其中SCAR標記(通常為18～24 bp)具有較高的特異性和可重復性，是鑒定植物的重要標記之一。利用RAPD、AFLP、SSR和ISSR技術，已開發出多種類型的小麥SCAR標記。陳林剛等利用200個RAPD隨機引物，經BLAST分析和Southern雜交鑒定，篩選出3條華山新麥草基因組的特異重復序列，但尚未轉化為SCAR標記。隨后，研究者們利用RAPD標記開發了一系列特異性SCAR標記，包括5個Ns基因組特異性SCAR標記、1個1Ns染色體特異性SCAR標記、2個3Ns染色體特異性SCAR標記和3個5Ns染色體特異性SCAR標記。Du等也在278個SSR標記的基礎上，開發了華山新麥草1Ns染色體特異性SCAR標記。截止目前，尚未見2Ns、4Ns、6Ns和7Ns染色體特異性SCAR標記的研究報道。

為獲得華山新麥草2Ns染色體的特異性SCAR標記，本研究利用180個隨機引物R1～R180(10 bp)擬先篩選出華山新麥草2Ns染色體上的PAPD分子標記，然后將其轉化為特異性SCAR標記，并對SCAR標記的特異性進行驗證，以期準確快速地篩選出小麥-華山新麥草雜交后代(特別是大批量衍生材料)中含有華山新麥草2Ns染色體的材料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

親本普通小麥7182(AABBDD，2=6=42)、華山新麥草(NsNs，2=2=14)以及一套完整的小麥-華山新麥草二體附加系(1Ns～7Ns，2=44=22II)共9份材料，均由西北農林科技大學農學院陜西省植物遺傳工程育種重點實驗室提供(表1)。

表1 試驗中使用的材料

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA提取

采用CTAB法提取所有材料葉片的基因組DNA，使用ddHO稀釋至工作濃度。

1.2.2 RAPD分析

使用180個隨機引物(R1～R180)，以9個材料的基因組DNA為模板進行PCR擴增，篩選出華山新麥草特異RAPD標記。PCR反應體系為20 μL，包括2 μL 10×PCR Buffer，1.6 μL dNTPs(2.5 μmol·mL)，2 μL引物(5 μmol·mL)，2.5 μL模板DNA(100 ng·μL)，0.2 μL Taq酶(5 U·μL)，11.7 μL ddHO。反應程序：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性30 s，36.9 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，44個循環；72 ℃延伸10 min；12 ℃冷卻后4 ℃保存。擴增完成后，加入5 μL Loading Buffer，使用8%的聚丙烯酰胺凝膠進行電泳檢測，觀察并拍照保存。

1.2.3 擴增產物的克隆和測序

使用OMEGA公司的聚丙烯酰胺凝膠回收試劑盒對僅在華山新麥草及其二體附加系中擴增出的特異性條帶進行回收，然后連接到pMD19-T載體，將連接產物轉入大腸桿菌DH5α感受態細胞。采用菌落PCR藍白斑篩選法篩選陽性克隆，送上海生物工程有限公司進行測序。

1.2.4 測序結果的分析與SCAR引物的設計

使用Oligo 7.37進行序列分析，并在NCBI網站使用BLASTn和BLASTx進行序列同源性比對。根據RAPD產物的核苷酸序列，利用Primer Premier 5.0設計候選SCAR引物。SCAR引物的設計包括18～22個堿基和相應RAPD片段框架內的結合位點，由北京奧科生物技術有限公司合成。

1.2.5 SCAR標記的檢測與分析

以9個材料的基因組DNA為模板，對特異SCAR標記進行PCR檢測。PCR反應體系同 1.2.2，反應程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性50 s，65 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35個循環；72 ℃延伸5 min；12 ℃冷卻后4 ℃保存。擴增完成后，使用1%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測并分析。

2 結果與分析

2.1 2Ns染色體特異RAPD標記鑒定結果

用R1～R180這180個引物對9個供試材料進行初步篩選，共發現有26個特異引物，其中21個為華山新麥草基因組特異性RAPD標記，4個為華山新麥草其他染色體特異性標記，僅有1個引物R131(GTGCAACGTA)為2Ns染色體特異性標記。進一步利用R131引物對9個供試材料進行檢測，結果(圖1)發現，僅在華山新麥草及其2Ns二體附加系中擴增出一條約1 000 bp的特異性條帶，而在其他6個二體附加系和普通小麥7182中均未擴增出該條帶(圖1)。因此，R131可以作為華山新麥草2Ns染色體的特異性標記。

1：1Ns二體附加系；2：2Ns二體附加系3：3Ns二體附加系；4：4Ns二體附加系；5：5Ns二體附加系；6：6Ns二體附加系；7：7Ns二體附加系；8：普通小麥7182；9：華山新麥草；M：DNA marker。箭頭所示為華山新麥草及其2Ns二體附加系上的特異擴增產物。圖4同。

2.2 序列分析

回收R131引物擴增出的華山新麥草2Ns染色體特異性條帶，連接到pMD19-T載體，將連接產物轉入大腸桿菌DH5α感受態細胞，菌落PCR發現，陽性克隆可擴增出一條約1 000 bp的條帶(圖2)，對其進行測序，得到全長為1 126 bp的片段，命名為F，其序列如圖3所示。序列分析表明，F的GC含量為50.9%，但沒有發現內部串聯重復序列、反向重復序列以及回文序列等特征。將該序列提交到NCBI數據庫，登錄號為MF405182。序列比對分析未發現NCBI數據庫中有與F相同的序列，而URGI數據庫中的BLAST搜索顯示F的239個核苷酸(核苷酸238到536)與3DL染色體參考序列的同源性為80%，表明F與公共數據庫中的序列無顯著的同源性。

箭頭表示單克隆菌落PCR擴增帶FR-131。

2.3 特異性SCAR標記的設計與驗證結果

根據F的克隆序列，利用Primer Premier 5.0設計特異SCAR標記引物S131，長度為561 bp。S131序列在圖3中用雙線表示，即S131-F：CAACCTGCCTAACTCTATGTCA和S131-R：CGACTTGGGGAGAAGGCTG。

雙下劃線部分表示SCAR標記S131的上、下游引物。

利用S131對9個供試材料進行驗證，結果(圖4)顯示，僅華山新麥草及其2Ns二體附加系可擴增出561 bp的條帶，而在其他材料中均未擴增出該條帶，表明該條帶是華山新麥草2Ns染色體所特有，即2Ns染色體特異條帶。此結果證明，RAPD標記R131已成功轉化為特異SCAR標記S131，可用于快速準確地鑒定華山新麥草2Ns染色體。

圖4 SCAR引物R131在小麥-華山新麥草二體附加系及其親本中的擴增結果

3 討 論

在小麥育種中，利用小麥野生近緣植物中的優良基因可以提高小麥的產量、品質以及抗逆性。然而，只有當外源遺傳物質較少時，連鎖阻力減小，減數分裂行為趨于規則，這些外源優良基因才可以被小麥育種者利用，為了利用這些優良基因，在進一步產生易位系(特別是小片段易位系)之前，需要構建對應的附加系和代換系。因此，如何快速準確地鑒定外源染色體(片段)是否已轉入普通小麥至關重要。

華山新麥草由于其具有良好的性狀被世界各地的育種家作為重要的供體廣泛利用。特別是2Ns染色體上含有可以增加小花數、穗粒數、分蘗數和穗長的基因，為提高小麥產量提供了新的遺傳資源。另外，小麥-華山新麥草2Ns二體附加系和2Ns/2D二體代換系對條銹病具有較強的抗性，因此，華山新麥草2Ns染色體的抗條銹病基因可以改善小麥對條銹病的抗性，進一步提高小麥的產量潛力。鑒于小麥-華山新麥草2Ns二體附加系的優良性狀，準確有效地將含有2Ns染色體的材料與大量的小麥-華山新麥草雜交后代區分開來具有重要的意義。雖然目前已經開發了RAPD、EST-SSR、EST-STS等標記，可用來篩選小麥-華山新麥草2Ns二體異附加系和異代換系，但與SCAR標記相比，它們操作復雜，成本更高。而SCAR標記只需要對每個植物樣本進行一次反應，且具有更高的重復性、穩定性和特異性。研究證實，特異SCAR標記可用于高效、快速地鑒定目標物種中的外源染色體(片段)。

本研究用180個隨機引物對一整套小麥-華山新麥草二體附加系及其親本進行了篩選。在這些引物中，共篩選到21個華山新麥草基因組特異RAPD標記和5個華山新麥草染色體特異標記，華山新麥草染色體特異標記的篩查率明顯低于其基因組特異標記。以前的研究已經證實了這一觀點。由于RAPD標記的設計不依賴于華山新麥草的基因組序列，并且普通小麥與華山新麥草基因組序列之間幾乎沒有同源性，那么華山新麥草染色體特異性標記的篩選效率低于其基因組特異性標記可能是由于華山新麥草同源類群之間基因組序列的同源性相對較高。本研究只有1個RAPD引物成功轉化為穩定的SCAR標記，表明從RAPD標記轉化為SCAR標記的效率較低，這與蘇佳妮等的觀點一致。在本研究中，RAPD標記的退火溫度由前人研究的32.0～34.0 ℃被優化為36.9 ℃，可以消除非特異性條帶。因此，本研究開發的華山新麥草2Ns染色體SCAR標記的特異性更高，更穩定，根據特定條帶的存在與否，對結果更容易觀察判斷，有利于大量樣品的快速分析。華山新麥草染色體特異性SCAR標記如1Ns、3Ns和5Ns染色體特異性SCAR標記已有報道。未來的研究中，可進一步開發華山新麥草其他染色體上的SCAR標記，為華山新麥草在小麥育種中的高效利用奠定基礎。

4 結 論

本研究利用RAPD技術開發了一個特異性SCAR標記S131，可用于快速、準確地篩選含有2Ns染色體的小麥-華山新麥草雜交后代，為利用2Ns染色體上的優良基因奠定基礎。RAPD和SCAR的結合為追蹤華山新麥草及其他物種的染色體(片段)提供一種簡單、可靠的方法。