鎘暴露對斑馬魚胚胎發育的毒性效應研究

羅紫蝶，郭少娟，曾 晨，張元元，王睿虹，楊立新

中國環境科學研究院，環境基準與風險評估國家重點實驗室，北京 100012

鎘是環境中具有極強毒性的重金屬污染物之一，屬于人體非必需的微量金屬，被廣泛用于金屬冶煉、塑料制造、涂料及電池等行業[1-2]. 聯合國環境規劃署把鎘列為重點環境污染物[3]. 鎘通常以離子形式廣泛存在于生產和生活環境中. 工業生產是鎘人為排放的主要來源，電子拆解地PM10中污染物的致癌風險大部分由鎘引起[4]. 我國土壤鎘污染較嚴重[5-6]，長江流域及東南沿海地區的水稻田鎘含量平均值為0.52 mg/kg[7]，超過GB 15618—2018《農用地土壤污染風險管控標準(試行)》標準限值(0.30 mg/kg). 鎘不易被降解，會隨廢水、廢氣不斷釋放到環境中，導致環境負擔不斷增加，并可進入食物鏈.

鎘一般通過呼吸、皮膚吸收和飲食進入生物體并產生累積[8]，從而對生物體產生毒性效應. 長期暴露于鎘可導致肝毒性[9]、腎毒性[10]、骨骼毒性[11]及癌癥[12]. 研究表明，孕期接觸鎘不但影響胎盤的發育和功能，還會通過胎盤進入胎兒體內，干擾胎兒的正常發育[13]，影響語言和認知能力[14]. 低劑量的鎘導致小鼠腸道微生物群改變，加速肝臟脂質代謝，造成終生代謝異常[15]. 長期鎘溶液暴露將激活玉米螟幼蟲金屬硫蛋白基因Mtn的表達，抑制抗氧化基因Cat和GPx的表達；同時顯著提高幼蟲的脂質過氧化水平，降低幼蟲的發育速度和成活率[16]. 鎘暴露導致黑腹果蠅幼蟲體長縮短、體重減少，抑制baz和tj等與發育相關基因的表達，這些影響會傳遞給未暴露的后代[17].

斑馬魚胚胎具有體外發育、發育速度快和胚胎透明等優點[18]，廣泛用于研究污染物對生物體的發育毒性[19]. 斑馬魚胚胎對鎘的敏感性較強，暴露于3.00 mg/L鎘96 h導致斑馬魚胚胎孵化延遲、小頭、心率降低、體節缺失，且對外界刺激不敏感等[20]. 鎘暴露抑制斑馬魚胚胎atp2b1a、pth1、stc1等與Ca2+調節相關基因的表達，影響胚胎的耳石發育，導致游泳活動受損[21]. 鎘暴露影響斑馬魚胚胎中后腦發育，抑制ngn1、zash1a、zash1b和NeuroD的表達，影響神經元分化，最終產生神經毒性[22]. 暴露于35.60 μmol/L鎘會抑制nanos、piwi、dazl等生殖調控基因的表達，影響早期生殖細胞的數量和遷移，造成生殖毒性[23-24].

鎘具有胚胎發育毒性，然而鎘產生發育毒性的關鍵因素尚不明晰. 因此，該研究在前期試驗[25]基礎上，用5個不同鎘濃度暴露的斑馬魚胚胎分析鎘暴露的濃度-效應關系. 選取與氧化應激、轉錄翻譯和早期神經發育相關的prdx1、gstp1.2、atf3、jdp2b、hsp70l、hsp90aa1.1、eif4a1b和fabp7a基因，結合原位雜交和定量PCR方法，探究暴露于7.50 mg/L鎘對上述基因在斑馬魚胚胎組織和器官表達的影響，揭示鎘影響早期胚胎發育過程的分子事件，以期為闡明鎘產生胚胎發育毒性的機制提供依據.

1 材料與方法

1.1 斑馬魚

野生AB型斑馬魚購于中國國家斑馬魚研究中心，培養于中國環境科學研究院循環養殖系統(北京佰安智能科技有限公司). 培養條件：溫度為(28.5±0.5) ℃；pH為7.0±0.5；光暗循環為14 h/10 h；早晚喂食豐年蝦兩次. 產卵前一天，將雄魚和雌魚以2∶1的比例置于產卵盒中收集受精卵. 胚胎用ISO15088標準配制的水溶液(294.00 mg/L CaCl2·2H2O, 123.30 mg/L MgSO4·7H2O, 63.30 mg/L NaHCO3, 5.50 mg/L KCl)培養. 斑馬魚胚胎發育階段按照斑馬魚胚胎發育分期[26]進行區分.

1.2 儀器與試劑

儀器包括體視顯微鏡(日本尼康公司，SMZ 745型)、熒光顯微鏡(德國徠卡顯微系統有限公司，M165 FC型)、常規PCR儀(美國BIO-RAD)、熒光定量PCR儀(美國Thermo，7300 Plus型). 試劑包括CdCl2(西亞試劑)、限制性內切酶CeuⅠ/SacⅠ/SacⅡ及T7/SP6轉錄酶(美國Sigma)、DNA聚合酶和定量PCR試劑盒(美國Promega)、TRLzol(美國Ambion)、DIG-RNA及anti-DIG-AP、硝基藍四氯唑(NBT)、4-氯-3-酰磷酸溴(BCIP，瑞士Roche).

1.3 鎘暴露對斑馬魚胚胎的影響研究

1.3.1 基因克隆

用NCBI引物設計方法獲取擴增prdx1、gstp1.2、atf3、jdp2b、hsp70l、hsp90aa1.1、eif4a1b、fabp7a基因的引物. 引物由北京金唯智測序公司制備. 將上述基因擴增、回收DNA，克隆到T-載體上(參照Promega的標準方法). 挑選并培養陽性細菌，提取質粒，測序驗證目的基因.

1.3.2 胚胎暴露

按照OECD236標準方法，設置5個濃度，計算鎘的半致死濃度(LC50). 根據LC50數據，設置暴露組CdCl2濃度為7.50 mg/L，該濃度能產生可觀察的發育異常，同時導致胚胎死亡率低于5%. 胚胎于生物培養箱28.5 ℃下培育2～4 h后，挑選發育正常的胚胎進行暴露試驗，暴露時間為4～48 hpf (hours post fertilization, 受精后小時).

1.3.3 原位雜交

按照實驗室建立的方法[27]進行原位雜交試驗，即用限制性內切酶酶切回收目的基因，用SP6/T7轉錄酶合成插入地高辛標記的RNA探針，溶解于50 μL雜交液，并保存于—20 ℃備用.

收集48 hpf的對照和鎘暴露斑馬魚胚胎(16～25個)，去除絨毛膜，BT-fix溶液固定24 h，經甲醇脫水后，保存于甲醇溶液，—20 ℃保存備用. 固定胚胎經清洗，蛋白酶K處理后，加入制備的探針，65 ℃雜交16 h. 梯度濃度SSC緩沖液清洗，加入anti-DIG-AP后4 ℃培育16 h. 用1×PBST清洗后，使用BCIP/NBT溶液染色. 體視顯微鏡拍攝染色照片.

1.4 數據處理

1.3.4 定量PCR

收集48 hpf的對照和鎘暴露的斑馬魚(每組60個)，TRLzol提取總RNA，逆轉錄成cDNA，每組3個生物學重復，進行定量PCR，反應條件：95 ℃維持2 min；95 ℃維持30 s、55 ℃維持30 s、72 ℃維持1 min，循環30次；72 ℃維持5 min，4 ℃維持30 s.引物序列如表1所示.

表1 定量PCR引物序列Table 1 Gene quantitative PCR primer sequences

用IBM SPSS 20軟件進行統計分析，計算鎘的LC50及95%置信區間. 選擇在斑馬魚胚胎中表達量穩定的GAPDH基因作為內參基因，用2—△△Ct相對定量計算方法定量分析基因表達差異. 通過GraphPad Prism 8軟件，采用One-way ANOVA對目的基因的表達差異進行分析(P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著).

2 結果與討論

2.1 鎘暴露對斑馬魚胚胎的半致死濃度

通過暴露試驗，計算得到鎘暴露對斑馬魚胚胎120 hpf的半致死濃度，并通過體視顯微鏡觀察到斑馬魚胚胎發育的毒性效應. 根據3次重復試驗結果，繪制鎘的濃度-效應關系曲線〔見圖1(a)〕，當胚胎死亡率達到50%時，對應的鎘濃度為15.20 mg/L. 暴露于20.00 mg/L鎘4～48 hpf的斑馬魚胚胎存在頭部和眼睛變小、體長縮短、軀干彎曲、卵黃囊異常以及心臟發育異常等畸形形態〔見圖1(b)(c)〕.

圖1 鎘暴露對斑馬魚胚胎的影響Fig.1 Effects of cadmium on zebrafish embryos

2.2 鎘暴露影響基因在斑馬魚胚胎組織中的表達

選擇暴露于7.50 mg/L鎘的胚胎分析暴露48 hpf后，基因在斑馬魚胚胎組織和器官中的表達情況，發現鎘主要誘導基因在神經組織、視網膜、晶狀體，嗅球、側線、心臟以及皮膚等組織和器官中異常表達 .對照組胚胎prdx1基因主要在下丘腦表達〔見圖2和圖3(a)〕，鎘暴露導致prdx1基因在嗅球、側線器官和上皮細胞的異常表達〔見圖2和圖3(a′)〕. 相較于對照，鎘導致gstp1.2基因在下頜和側線及血細胞中表達異常〔見圖2和圖3(b)(b′)〕. 鎘誘導atf3基因在中后腦間隔、心包區域和嗅球異常表達，在胸鰭原基和尾鰭原基中表達量上升〔見圖2和圖3(c)(c′)〕.jdp2b基因在鎘暴露胚胎的上皮細胞、胸鰭原基、心包區域、側線和尾鰭原基處表達異?！惨妶D2和圖3(d)(d′)〕.鎘誘導hsp70l基因在嗅球和體節肌肉異常表達，同時在眼睛晶狀體和脊索中表達量上升〔見圖2和圖3(e)(e′)〕.在鎘暴露的胚胎中，hsp90aa1.1基因在胚胎的嗅球、眼睛晶狀體和下頜肌肉表達異常，同時在中后腦間隔、胸鰭肌肉和體節肌肉中表達上升〔見圖2和圖3(f)(f′)〕.鎘導致eif4a1b在頂蓋、視網膜、晶狀體、下頜、胸鰭原基和體節肌肉中異常表達〔見圖2和圖3(g)(g′)〕.鎘誘導fabp7a基因在端腦、中后腦、延髓以及眼睛表達量上升，在脊髓和脊索出現異常表達〔見圖2和圖3(h)(h′)〕.

圖2 對照組和鎘暴露組斑馬魚胚胎基因表達情況Fig.2 The gene expression organs of zebrafish embryos in control and exposed to cadmium

圖3 鎘暴露組斑馬魚胚胎基因頭部異常表達現象Fig.3 The changes in gene expression at anterior part of zebrafish embryos

2.3 鎘暴露對胚胎基因相對表達量的影響

與對照組相比，鎘暴露導致prdx1、gstp1.2、atf3、jdp2b、hsp70l、eif4a1b和fabp7a基因相對表達量顯著上調，分別上調2.31、3.58、2.08、3.42、5.27、1.42和2.06倍(見圖4).hsp70l基因主要參與應激反應和對金屬離子的反應[28]，gstp1.2和prdx1基因主要參與抗氧化過程[29]，atf3和jdp2b基因具有DNA結合轉錄因子活性[30]，eif4a1b基因具有翻譯起始因子活性[30]，fabp7a基因在早期神經發育過程中起重要作用[31]. 這些基因相對表達量的顯著上調表明，鎘影響斑馬魚胚胎的氧化應激、轉錄翻譯和早期神經發育等過程.

圖4 鎘暴露對斑馬魚胚胎基因相對表達量的影響Fig.4 The relative expression levels of genes induced by cadmium on zebrafish embryos

2.4 鎘暴露對斑馬魚胚胎發育的影響

通過研究鎘對8個基因在斑馬魚胚胎組織和器官表達的影響，發現鎘不但誘導基因在神經組織、視網膜、晶狀體，嗅球、側線、心臟以及皮膚等組織和器官中異常表達，而且影響基因在相應組織和器官中的表達水平，表明鎘影響斑馬魚胚胎的多個組織和器官的發育.

研究表明，鎘主要通過芬頓反應置換金屬離子，產生多余的ROS，進而造成氧化應激[32]，并通過干擾體內鈣離子運輸，影響蛋白質正常生理功能等[33]產生毒性效應. 筆者研究的8個基因中，有5個基因在鎘暴露后的斑馬魚胚胎中于嗅球處異位表達，并且定量PCR結果顯示，其中4個基因在鎘暴露后表達量顯著升高. 這5個基因包括轉錄調控基因atf3[34]，氧化應激反應相關基因atf3[35]、gstp1.2[29]、prdx1[36-37]、hsp70l[38]、hsp90aa1.1[39]，免 疫 調 控 相 關 基 因atf3[40]、prdx1[41]及血管形成相關基因prdx1[42].atf3基因屬于亮氨酸拉鏈轉錄因子家族，哺乳動物中ATF3在受到毒性傷害的組織、癲癇發作后的大腦等細胞應激部位中表達顯著[43].gstp1.2基因在多種細胞過程中發揮重要作用，包括親電子化合物的催化和脫氧、氧化應激調節、細胞信號傳導和致癌作用[44]，主要參與代謝、解毒并保護細胞免受DNA損傷和癌變[45-46].prdx1基因也是重要的抗氧化基因，其維護基因穩定性及防止突變[36]，并且參與細胞生長、增殖、免疫響應及細胞凋亡等過程[37，41].hsp70l介導多種生物過程，參與斑馬魚的熱適應、長期存活[47]和低溫應激過程[48]. 研究發現，低溫刺激顯著增加雞心臟和免疫器官Hsp70 mRNA的表達[49]，具有保護脾臟和盲腸受到氧化應激反應和炎癥損傷的作用[50].hsp90aa1.1基因屬于熱休克蛋白家族，參與早期肌肉發育和多種蛋白質的折疊、激活和組裝[51]，以及對金屬離子的反應[52]. 研究[53]發現，鎘暴露激活prdx1和hsp70等與氧化應激相關基因的表達，造成斑馬魚嗅覺損傷，導致斑馬魚捕食及抗捕食者的行為缺陷. 鎘暴露會破壞嗅覺上皮基底細胞層，降低大腦區域中的膜流動性進而影響嗅覺[54].

atf3、jdp2b基因在斑馬魚胚胎的心包區域異常表達.jdp2b基因具有DNA結合轉錄因子活性. 哺乳動物中JDP2在抑制由組蛋白乙酰轉移酶引起的組蛋白乙?；^程中具有重要作用，其可以通過形成同型二聚體或招募組蛋白去乙?；窩RE，并與TRE DNA元件結合形成異型二聚體來抑制轉錄[55]，也可以通過與CHOP10結合[56]或作為類固醇激素受體[57]激活轉錄. 轉基因小鼠研究[58]發現，JDP2過表達會引起小鼠心房擴張和輕微心室增厚，導致4周齡jdp2轉基因小鼠的死亡率明顯上升. 作為JDP2同系物的ATF3，其過表達也會引起小鼠心臟肥大和功能障礙. 鎘誘導atf3、jdp2b在胸鰭原基和尾鰭原基表達量上升，誘導jdp2b和gstp1.2基因在側線器官異常表達，說明鎘可能影響斑馬魚胸鰭、尾鰭和側線器官的發育. 斑馬魚的側線器官主要感受水流變化，由毛細胞和支持細胞組成，Wnt、FGF和Notch信號通路是斑馬魚側線發育的主要調控因子[59]. 筆者研究中jdp2b與gstp1.2基因在白細胞處出現異常表達，近期研究[60]發現，甲基汞處理的斑馬魚胚胎也存在白細胞異常表達的現象，并且該研究發現白細胞參與側線發育過程.jdp2b與gstp1.2基因在側線和白細胞中的異常表達與斑馬魚胚胎側線發育的關系需進一步研究.

鎘誘導eif4a1b、hsp90aa1.1基因在眼睛晶狀體異常表達. eIF4A是一種ATPase/RNA解旋酶，參與翻譯過程，在新生小鼠的晶狀體纖維細胞中高表達[61].研究[62]顯示，hsp90α基因參與魚類發育過程中晶狀體細胞的凋亡過程. 已有研究[63-64]證明，鎘通過阻斷神經嵴的形成、抑制視網膜神經元的分化和破壞視網膜神經節細胞的軸突形成等過程影響斑馬魚胚胎眼睛的發育. 鎘誘導eif4a1b和hsp90aa1.1基因在晶狀體中的異常表達與斑馬魚晶狀體發育和視覺功能的關系需要進一步研究.fabp7a基因在斑馬魚神經系統發育過程中發揮重要作用[31]，其在中樞神經系統和視網膜中表達，Notch信號通過維持fabp7a基因的表達來調控神經周圍神經膠質細胞的發育[65]. 此外，該基因也一定程度上參與了眼睛發育過程[66]. 鎘暴露導致其表達量顯著上調，鎘是否通過影響fabp7a基因在中樞神經的表達進而影響神經功能，需進一步研究.

3 結論

a) 20.00 mg/L鎘暴露導致斑馬魚胚胎出現小頭、小眼、軀干彎曲、心包水腫、卵黃囊異常以及死亡等異常，計算得到鎘暴露120 hpf后斑馬魚胚胎的LC50濃度為15.20 mg/L.

b) 7.50 mg/L鎘誘導prdx1、gstp1.2、atf3、jdp2b、hsp70l、eif4a1b和fabp7a基因的表達量顯著上升，說明鎘可能影響斑馬魚胚胎的氧化應激、轉錄翻譯和早期神經發育等過程.

c) 7.50 mg/L鎘誘導基因在神經組織、視網膜、晶狀體、嗅球、側線、心臟以及皮膚等組織和器官異常表達，說明鎘可能通過影響基因的表達區域，干擾斑馬魚胚胎的多個組織和器官的發育，進而造成嗅覺、視覺和運動等功能缺陷.