微流控電阻抗檢測及其在顆粒分選中的應用*

鄭力升， 王一鳴， 李保慶， 褚家如

(1.中國科學技術大學 精密機械與精密儀器系，安徽 合肥 230027；2.中國科學技術大學 安徽省高等學校精密科學儀器重點實驗室，安徽 合肥 230027)

0 引 言

從異質的混合物中按某種性質或類型對目標顆粒或細胞進行分選是許多生物醫學領域中的重要步驟[1]。在眾多生物醫學應用中，例如癌癥的早期診斷[2]、細胞分化研究[3]、藥物篩選[4]等都需要首先將包括細胞在內的生物顆粒進行分離。因此，將生物顆粒分離成同質種群的技術在近年來得到了深入的研究。

目前,許多顆粒分選方法是用顆粒的生化特性作標記，通過添加外部力場實現顆粒的分離[5,6]。例如，熒光激活細胞分選(FACS)，需要預先對樣品進行熒光標記[7]；磁激活細胞分選(MACS)，需要細胞表面表達物以及磁珠表面與目標樣品結合的特異性抗體[8]。這兩種方法都存在要對目標樣品進行復雜且較長時間的預處理、需要經過專業培訓的人員和昂貴的設備等局限性。

微流控電阻抗檢測技術是微小顆粒檢測中非常有前途的方法之一[9,10]，具有無標記、多功能、實時和高通量的特點。當顆粒通過微流體管道中的電極時，就會有電信號的變化，這些電信號可傳達有關目標顆粒大小、形態、介電和機械特性等生物物理信息[11]，以及與運動相關的量，例如微通道內的顆粒速度和位置信息等[12]。

將電阻抗檢測技術與分選技術結合，可以實現異質性樣品的分選，并且無需對目標對象進行標記。例如，Schoendube J等人將電阻抗檢測與噴墨打印相結合，成功實現了在液滴中封裝單個顆粒或細胞[13]。但是通量很低，每分鐘只能封裝9個液滴，單顆粒率也只有73 %。De Wagenaar B等人使用電阻抗檢測和介電泳技術，從精子細胞中分選出了3 μm磁珠[14]。但分選結果缺乏定量的統計分析，而且其采用的介電極化技術可能會影響細胞某些特性。Zhu Z小組將電阻抗檢測與PDMS氣動閥相結合實現了不同大小的秀麗隱桿線蟲的分離[15]，分選通量約為每分鐘30只蠕蟲。原因是為了給蠕蟲的檢測和氣動閥的響應提供足夠的時滯，檢測與分選區域間隔距離很長，同時也會錯誤地分離一些蠕蟲。Choi G等人將表征顆粒變形能力的電阻抗測量與氣動控制的流體動力推拉機構結合實現不同變形能力的顆粒的分選[16]，通量高達每分鐘600個顆粒，然而分選純度不高，約為88 %。除了相鄰兩個太靠近的顆粒可能被錯誤地分選，另一個重要的原因是因為顆粒到達分選區域的時刻與分選脈沖在時間上不匹配，從而導致有可能被錯誤分選。綜上所述可以看出，要實現高通量的顆粒分選，在檢測與分選動作上必須具備有較高的檢測通量和快速的分選響應；要實現高精度的分選，提高分選純度，則需要精確預測顆粒位置，實現精準分選。

本文通過實時獲取和分析電阻抗信號得到聚苯乙烯小球的大小和速度信息，并對系統運行過程中各類時間進行了計算，以準確預測顆粒在管道中所處的位置，之后結合壓電分選技術[17,18]，實現了大小不同的顆粒的無標記檢測與分選。為了證明系統的能力，從10 μm和7 μm的混合聚苯乙烯小球溶液中分選出了10 μm的顆粒，分選的純度為94.9 %，分選通量為1.6 Hz。本文方法為基于電阻抗檢測的無標記細胞分選技術研究提供了新的途徑，在單細胞檢測與單細胞組學研究中有著廣闊的應用前景。

1 系統設計與工作原理

基于電阻抗檢測的顆粒分選系統如圖1(a)所示。含有顆粒的懸液通過樣品入口引入，樣品流受到來自側面入口的兩條相等的流的橫向約束，并被迫進入管道中心的狹窄流中。這確保了懸浮顆粒能依次穿過位于下游的電極檢測和壓電分選區域。

顆粒的電阻抗測量是通過三個平行共面電極實現的。隨懸液流動的每個顆粒在流經電極時會產生一對正負峰值的組合，不同大小的顆粒產生的峰值幅度是不同的。對測得的信號進行實時的分析，準確預測顆粒在管道中所處的位置，并使用基于閾值的觸發信號進行分選。

當顆粒流經分選區域時，顆粒通過壓電致動器撞擊打印室上的柔性膜產生的局部流進行分選。這種分選方式不需要特定的緩沖溶液，而且壓電致動器響應時間很短(160 μs)。如果檢測到非目標顆粒，壓電致動器保持抬起狀態，主通道的液體直通，顆粒被沖入廢液通道，如圖1(b)左所示。當檢測到目標顆粒時，壓電致動器下壓并擠壓柔性膜，其內部液體被噴射到主通道中，使得目標顆粒的流動路徑發生變化，并進入下行收集通道，如圖1(b)右所示。將分選區域后的通道設計為三個出口的模式，是為了讓芯片的結構對稱，在形成鞘流和產生分選動作時更有利。

圖1 顆粒分選系統的設計與工作原理

2 方法與材料

2.1 微流控芯片的制作與設計

電阻抗分選芯片包含三個部分：轉接塊、微通道層和電極層，如圖2(a)所示。轉接塊是聚二甲基硅氧烷(poly-dimethyl-siloxane,PDMS)立方體，帶有用于連接顆粒懸浮液的孔。微通道層是通過軟光刻制造的，具體過程如下：使用負光刻膠(MicroChem SU—82025)在玻璃基板上對20 μm厚的微通道模具進行圖案化；將 PDMS 預聚物與固化劑以10︰1的比例混合(Dow Corning SYLGARD184)并倒在光刻膠模具上，PDMS厚度為350 μm，在65 ℃下烘烤2 h固化；固化后，PDMS 微通道層使用手術刀切割并被剝離，并打孔以與轉接塊連接。電極層是通過Lift-off工藝制備的。首先，在玻璃基板上旋涂正光刻膠S1813并通過光刻對電極進行圖案化。然后，通過磁控濺射機沉積10 nm的Cr和75 nm的Au。將覆蓋金屬的玻璃基板放入丙酮中浸泡3 h實現電極的剝離。電極層和微通道層進行氧等離子體處理后，在顯微鏡下將微流體管道和電極對準并鍵合組裝。轉接塊通過氧等離子體處理與微通道層鍵合。電阻抗芯片制作好后，將其嵌入定制的印刷電路板(printed circuit board,PCB)中，以實現與外圍檢測設備的穩定電氣連接，并減少噪聲的干擾。

為了實現顆粒的良好檢測與分選，電極的寬度為20 μm，相鄰電極之間的間距為30 μm。微流體主管道的寬度為250 μm，分選區域的長度也為250 μm。電極右側與分選區域之間的距離約為1 500 μm，一方面是為了給電阻抗信號的采集和實時處理提供足夠的時間滯后，另一方面是為了減小分選過程中流體偏轉對電阻抗信號的擾動，如圖2(b)所示。

圖2 微流控芯片的制作與設計

2.2 實驗裝置

將直徑為10 μm的聚苯乙烯小球和直徑為7 μm的聚苯乙烯小球以1︰1的比例混合，并懸浮于 1×PBS 溶液中來制備顆粒懸浮液，該PBS中含有足夠的蔗糖以使懸浮介質的密度與顆粒的密度(1 050 kg/m3)匹配，兩種顆粒的濃度都為1×105個/mL。為了防止顆粒聚集，在實驗之前對樣品進行超聲處理。鞘流液為含有染料和足夠蔗糖的1×PBS 溶液。用壓力控制系統(MFCS-EZ,Fluigent,France)控制微流體裝置中鞘流的形成以及樣品顆粒的連續泵入。為了實時觀測顆粒在管道中的運動狀況，將高速相機(2F04，Revealer，中國)與倒置顯微鏡(MF52，MSHOT，中國)結合實時觀測管道中的顆粒。

2.3 電阻抗檢測與分析

使用配備跨阻放大器(HF2TA，Zurich Instruments，Switzerland)的鎖相放大器(HF2LI，Zurich Instruments，Switzerland)以差分模式記錄電阻抗數據。鎖相放大器的輸出端給中間電極施加頻率為1 MHz，幅度為1 V的交流電壓信號，跨阻放大器將另外兩個電極測得的電流信號轉換為電壓信號并傳輸到鎖相放大器(增益為1 kΩ)。鎖相放大器以100 Hz的低通濾波器帶寬和899 Sa/s的采樣頻率以差分模式記錄數據。在顆粒分選實驗中，使用MATLAB(MathWorks,USA)中的定制程序實現電阻抗信號的實時記錄和處理。

3 結果與討論

3.1 不同大小顆粒的電阻抗信號獲取

本實驗中要實現對不同大小的聚苯乙烯小球的分選，首先需要對不同大小的顆粒的電阻抗檢測信號進行分析。圖3(a),(b)分別為直徑為10 μm和直徑為7 μm的聚苯乙烯小球的典型電阻抗信號波形圖，不同大小的顆粒在流經電極時都會產生一對正負峰值的組合，提取正負峰值的幅度表征顆粒大小，提取正負峰值之間的時間間隔以計算顆粒的速度。

圖3(c)顯示了直徑為10 μm和7 μm的聚苯乙烯小球按數量比1︰1混合時持續測量60 s所獲得的電阻抗信號。其中，方點標記的是直徑為10 μm的聚苯乙烯小球，圓點標記的是直徑為7 μm的聚苯乙烯小球。相同大小的顆粒產生的峰值幅度并不完全相同，這主要是由于共面電極的位置依賴性：電場沿著微流體通道的高度方向是不均勻的，沿著不同高度流動的顆粒會產生不同的信號峰值幅度。圖3(d)為兩種顆粒的負峰值幅度的散點圖，兩種顆粒的峰值幅度分別為(147.62±11.04)μV和(53.70±3.75)μV(兩種顆粒的數量各為120個)，不同大小的顆粒峰值幅度存在著明顯的偏差，可用作區分兩種顆粒的可靠指標。

圖3 不同大小顆粒的電阻抗信號表征

3.2 顆粒的位置預測與誤差分析

為了與下游的壓電分選實現良好的結合，需要對電阻抗數據進行實時記錄和處理，以預測觸發分選時刻顆粒在管道中所處的位置。

圖4(a)所示為電阻抗信號處理的程序流程圖。程序運行時，會實時的獲取特定時間長度的電阻抗數據(采集區間為0.2 s，包含時間及對應的電壓值)。首先，通過一次多項式擬合進行電壓信號的基線消除；其次，尋找所有的波峰及波谷位置(即正負峰值的時間點)及其對應的幅度(即正負峰值的電壓值)，為了實現某種特定顆粒的分選，波峰與波谷處的電壓值會與預先設定的閾值作比較，如果波峰與波谷處的電壓值都在設定的閾值范圍內，說明此時檢測到了一個想要分選的目標顆粒并獲取了一個完整的正負峰值波形。然后，根據正負峰值之間的時間差以及電極間隙之間的距離計算顆粒的速度，并估計顆粒到達分選區域所需的延時。最后，給壓電致動器或高速相機發送觸發信號。

電阻抗檢測和分選的程序流程雖然簡單，但它涉及許多需要在連續流中同步的耦合過程。圖4(b)所示為電阻抗信號的實時處理時序圖。虛線框中為實時獲取的特定時間長度的電阻抗數據，并恰好包含了一個目標顆粒的完整正負峰值波形(已經過基線消除和波峰與波谷的閾值匹配)。其中，tsum為顆粒從波谷位置到分選區域所需的總時間，是由顆粒從波谷位置到分選區域的距離除以顆粒的速度得到的；tvalley為顆粒電阻抗信號的波谷所在時刻到本次數據采集結束時刻所持續的時間；tprocess為程序運行消耗的時間(為15～25 ms)；tadjust為調整時間(為20～60 ms)；以上4個值是通過程序計算得到的。tdelay為顆粒到達分選區域所需要給定的延時，具體計算公式如下

tdelay=tsum-tvalley-tprocess-tadjust

(1)

在給定相應的延時tdelay后，給壓電致動器或高速相機發送觸發信號。其中，顆粒在觸發時刻與波谷位置的時間差理論上與tsum是相同的，但實際上兩者的差值會在±5 ms之間波動，這可能是由于計算機內核的分時復用不穩定性導致的。

圖4(c)所示為10 μm的聚苯乙烯小球在速度約為5 mm/s時，經過以上程序的計算后，在觸發時刻顆粒在管道中所處的位置，統計的顆粒數量為83個。可以看出顆粒基本都位于分選區域中，說明提出的方法對預測顆粒在管道中所處的位置是較為準確的。但是沿著顆粒的流動方向，顆粒分布在一個長約290 μm的區間內，表明對顆粒位置的預測存在一定誤差。

圖4(d)所示為使用高速相機拍攝的顆粒速度與對應電阻抗速度的相對誤差。說明電阻抗測速存在一定誤差。最大誤差約為-5 %，這可能是造成顆粒在觸發時刻在管道內位置分布范圍較大的主要原因。除了顆粒測速不準帶來的誤差，其他可能原因有：顆粒在管道中的流動不是完全勻速的，尤其是在靠近分選區域時由于上下敲擊通道的存在，顆粒速度會減慢；電極和管道的制作可能存在一定的誤差；數據實時獲取和處理的程序仍需要優化等。

圖4 顆粒的位置預測

3.3 顆粒的分選

經過對壓電分選方法的分析，能實現正確分選的區域為沿著顆粒的流動方向長約320 μm的區間內。而上文經過預測顆粒位置得到的觸發區域都在合適的分選區域中，說明對顆粒位置預測的誤差在實驗允許的范圍內，從而證實了將電阻抗檢測與壓電分選結合實現顆粒分選的可行性。基于此，研究了從10 μm和7 μm的混合聚苯乙烯小球中分選出10 μm的顆粒。

圖5(a),(b)所示為在5 mm/s的速度下，被分選的10 μm顆粒和未被分選的7 μm顆粒在分選過程中的典型時間堆疊圖像。其中，10 μm的顆粒到達合適的分選區域時，壓電致動器下壓使得顆粒的流動路徑發生變化，并進入下行收集通道。而7 μm的顆粒通過時，壓電致動器不動，顆粒被沖入廢液通道。

圖5 顆粒分選的時間堆疊圖像

在分選實驗中，將兩種顆粒按數量比1︰1均勻混合。分選之前混合溶液在顯微鏡下的圖像如圖6(a)所示。

圖6 分選結果的表征

在分選過程中，將用于觸發分選的電阻抗信號的峰值幅度閾值區間設為100～200 μV，這樣單個7 μm的顆粒或者顆粒團通過時由于峰值幅度小于或大于閾值區間而不會觸發分選動作。而單個的10 μm顆粒通過時就會觸發分選從而進入下行收集通道。

實驗結束后，將收集腔中的溶液收集在離心管中，置于顯微鏡下觀察并手動計算10 μm和7 μm顆粒的數量(10 μm顆粒為388個，7 μm顆粒為21個)，得到10 μm顆粒的純度為94.9 %。圖6(b)所示為分選之后收集腔內溶液在顯微鏡下的圖像，圖中圓圈包圍的是7 μm顆粒。出現錯誤分選主要是因為不同大小的兩個顆粒距離太近或者7 μm顆粒聚團通過所導致的。

由于電極到分選區域之間的距離約為1 500 μm，在顆粒速度約為5 mm/s的情況下，顆粒從電極檢測到電阻抗信號到實現分選大約需要0.3 s，壓電致動器下壓后，需要等待顆粒流入下行收集通道后再抬起，時間約為0.3 s，所以理論上顆粒的分選通量約為每秒1.6個顆粒。

4 結 論

本文通過集成電阻抗檢測技術和壓電分選技術，實現了對不同大小的聚苯乙烯小球的無標記檢測與分選。文中所闡述的電阻抗數據的實時記錄和處理的方法可以準確預測在觸發分選時刻顆粒在管道中所處的位置，從而實現了與分選動作的良好匹配。為了證明這種顆粒分選系統的性能，從混合顆粒溶液中分選出了10 μm的聚苯乙烯小球，分選純度為94.9 %，通量為1.6 Hz。為基于電阻抗檢測的無標記細胞分選技術研究開辟了一個有前途的平臺。