C型肉毒梭菌毒力提高的試驗

次旦白瑪，彭燕娟，索朗卓嘎，李鴻仁

西藏自治區獸醫生物藥品制造廠,西藏拉薩 850008

肉毒梭菌是指能夠生產肉毒梭菌毒素，引起動物中毒的細菌總稱，其中C型肉毒梭菌最為常見。肉毒梭菌，也稱肉毒梭狀芽孢桿菌，是一種革蘭氏陽性芽孢梭菌，嚴格的厭氣菌，兩端鈍圓，多單在或成對，無莢膜，易于在液體培養基和固體培養基上形成芽孢，芽孢卵圓形，位于菌體近端。適合生長溫度為28～37 ℃，pH為6.8～7.6。肉毒毒素并非肉毒活的肉毒桿菌釋放，而是先在肉毒桿菌細胞內生產無毒的前體毒素，在肉毒桿菌死亡自溶后才具有毒性。

肉毒中毒分布于世界各地，我國主要分布在新疆、西藏、甘肅等地區，發病主要以青壯年牛為主，病死率高，常規治療無效。肉毒梭菌是一種土壤腐生性細菌，通常以芽孢形式廣泛分布于自然界和動物腸道，在適當環境條件下，芽孢發芽形成繁殖體，生長繁殖并產生毒素。肉毒梭菌芽孢有很強的抵抗力，在180 ℃下干熱5～15 min，100 ℃濕熱5 h左右，或高壓蒸汽121 ℃溫度滅菌30 min才能殺死肉毒梭菌芽孢。我廠肉毒梭菌C型滅活疫苗免疫效果良好，對牛羊的C型肉毒梭菌中毒癥得到了控制。我廠仍以常法生產，存在著產毒能力低、免疫注射計量大，給預防注射帶來一定的困難，疫苗生產成本也較高，為此進行了此次試驗[1]。

1 材料

1.1 菌種

肉毒梭菌C型菌株CVCC60353購自中國獸醫藥品監察所。

1.2 儀器

離心機型號：TGL-16LM-B；生物安全柜型號：BSC-1300ⅡA2；電熱恒溫培養箱型號：DHP-9272；冷藏冷凍箱型號規格：BCD-221WRB1NYC；顯微鏡 OLYMPUS CX41；電子天平型號：FA2004B。

1.3 培養基

肉肝胃酶消化湯半固體：西藏生藥廠小培組提供；新鮮肝子：研發組取健康兔子肝；50%葡萄糖；自制培養基：西藏生藥廠研發室制備。

1.4 試驗動物

由西藏生藥廠質檢室動物組提供，SPF級，體重14～16 g健康小鼠，隨機編組，不分雌雄。

2 試驗方法

2.1 分組

為了更能說服改進后肉毒梭菌C型毒力提高，我們做了三次重復試驗，即分為第一組、第二組、第三組。按照培養基和培養方法不同分為一號瓶、二號瓶。

2.2 制備培養基

3瓶500 mL研發室自制培養基，標記為一號瓶，進行120 ℃滅菌30 min冷卻后放常溫備用。3瓶500 mL肉肝胃酶消化湯半固體西藏生藥廠小培組提供，標記為二號培養基。西藏生藥廠小培組提供培養基加入無菌新鮮兔肝塊。

2.3 具體試驗方法如下

2.3.1 第一組培養方法

第一組一號瓶接種肉毒梭菌C型1.5%菌液，同時加入已滅菌0.2%葡萄糖（50%），培養期間進行流加方式加入自制的培養基，普通溫箱35 ℃培養7 d。二號瓶接種肉毒梭菌C型1.5%菌液，同時加入已滅菌0.2%葡萄糖（50%），普通溫箱35 ℃靜置培養96 h。

2.3.2 第二組培養方法

第二組一號瓶和二號瓶培養方法同2.3.1。

2.3.3 第三組培養方法

第三組一號瓶和二號瓶培養方法同2.3.1。

2.4 肉毒梭菌c型鑒定

1純粹檢驗：取第一組一號瓶和二號瓶肉毒梭菌C型種子，分別在TG小管、厭氣肉肝湯小管、GA小管培養基上接種，每種培養基接種2支，每支劑量為0.2 mL，其中1支在37 ℃環境下培養，另一只培養溫度為25 ℃。觀察3 d，檢驗結果為純粹，符合獸藥典的要求[2]。②培養特性：本菌為嚴格的厭氧菌，在肉肝胃酶消化湯半固體培養基中呈中等生長，在厭氣肉肝湯中生長不良或不生長，培養基加入新鮮生肝塊時，生長良好，產氣，有臭味。取第一組一號瓶和二號瓶肉毒梭菌C株種子，在鮮血瓊脂平板上厭氣條件下，37 ℃培養48 h，菌落為不規則的圓形，直徑3 mm左右，半透明，邊緣不整齊，有略大于菌落的溶血圈。培養結果符合獸藥典要求。

2.5 毒力試驗

取樣測定菌液上清毒素含量；用明膠磷酸鹽緩沖液進行稀釋，分別稀釋如下表1～3，每個稀釋度尾靜脈注射3只14～16 g小鼠，0.2 mL/只，連續觀察3 d并記錄小鼠死亡情況。

表1 第一組

3 結果

3.1 三組結果

表2 第二組

表3 第三組

各組小鼠死亡結果看出，對培養和培養方法改進后收獲的肉毒梭菌C型種子毒力遠遠高于改進前培養方法取得種子毒力。

3.2 鏡檢結果

肉毒梭菌屬于厭氣性梭狀芽孢桿菌屬，C型肉毒毒素在普通營養瓊脂平板上常見略帶黃色的中心，表面一般比較光滑，也有呈顆粒狀的。在較濕潤的平板上易生產成片狀[3]。血平板上比較大的β溶血環。C型肉毒毒素的形態一般粗大桿菌，約為4×1 μm的大桿菌，一般單個存在，偶見成雙或短鏈，兩端平行，兩端鈍圓、直桿狀或稍微彎曲，有4～8根周生鞭毛，運動遲緩，無莢膜，芽孢為卵圓型，位于次極端，使菌體呈鑰匙形狀或者網球拍形狀，偶有位于中央，常見很多游離芽孢。革蘭氏染色陽性。

4 討論

4.1 簡化操作方法

通過本次試驗對肉毒梭菌C型培養基和培養方法改進后得到菌液測定毒力結果能看出，我們自制的培養基和培養方法是對的，對比常規培養法既提高了毒價，又簡化了添加新鮮肝子繁瑣程序。

4.2 降低成本

肉肝胃酶消化湯半固體培養基制備繁瑣，成本高，而我廠研發室自制的培養基是干粉培養基，制備簡單，成本低。該操作方法無需加入新鮮肝塊，減少了種子用量，細菌生長及產毒具有較高的穩定性，細菌培養過程同時也是毒素的純化過程，工序簡單，有效解決了傳統培養方法的缺陷。

4.3 為我廠實施新版《獸藥質量管理規范》打下理論基礎

2020年6月1日起，所有獸藥生產企業要執行新版《獸藥生產質量管理規范（2020年修訂）》，目前西藏生藥廠生產C型肉毒梭菌滅活疫苗，仍以常法生產，存在著不易生長、產毒能力低、抗原純度差、免疫計量大等問題。這次通過改進培養基和培養方法不僅為我廠更好執行新版獸藥要求，（對肉毒梭菌C型發酵罐進行縮小）打下理論基礎，也更為西藏畜牧業穩定發展添磚加瓦。