3種消毒劑對早期鹵蟲幼體的毒性研究

蔣湘，呂美霞，許樂樂，朱文燕，魏亦彤，王鋰韞，陳道海*

（1.嶺南師范學院生命科學與技術學院，廣東 湛江 524048；2.廣東省粵西海鮮資源可持續利用工程技術研究中心，廣東 湛江 524048）

鹵蟲（）又稱鹽水豐年蟲、豐年蝦、鹽蝦或鰓足蟲，為廣溫耐高鹽型甲殼動物，屬于節肢動物門，甲殼亞門，鰓足綱，無甲目，鹽水豐年蟲科，鹵蟲屬（）。其分布廣，世界各地沿海高鹽水域、海岸鹽田及內陸鹽湖等均有分布。中國主要產地為長江以北沿海及內陸等地，天津長蘆鹽場是最著名的鹵蟲產地。鹵蟲具有較高的經濟價值與科研價值。鹵蟲生長迅速，繁殖周期短，幼體與成蟲富含蛋白質、脂肪酸和礦物質等營養物質，是海水養殖的優良餌料和天然誘食劑。鹵蟲能濾食鹽田中的藻類和固體懸浮顆粒，改良水質，提高產鹽質量。鹵蟲因其生活習性和生理結構，常用于環境污染物評價和生態毒理學研究，被列為標準實驗生物。

無節幼體期的鹵蟲存活率較低，養殖過程中容易受水體中原生動物（纖毛蟲、輪蟲）及攜帶的細菌病毒等感染，餌料投喂前，需定期對其培養水體進行消毒。高錳酸鉀（KMnO、甲醛（HCHO）和強氯精（TCCA）是一類常用的消毒劑，可以殺滅各種原生動物、病原微生物與細菌等，在水產養殖中應用廣泛，但是用量超過藥物安全濃度會導致養殖動物出現中毒甚至死亡。陳婕以美國舊金山大鹽湖品系為材料研究了HCHO對鹵蟲I期無節幼體的毒性，通過擬合回歸曲線計算出半致死濃度；劉淇等研究了TCCA等7種消毒劑對北方鹵蟲幼體的急性毒性；于利等研究了KMnO等4種消毒劑對山西兩性鹵蟲不同發育時期耐受力的影響；李玉全以河北鹽田鹵蟲為材料研究抗菌藥物恩諾沙星對鹵蟲無節幼體的急劇毒性等。以上研究多集中在中國內陸地區，利用人工配置海水來開展毒理研究，而在廣東沿海地區利用鹵水（天然海水析出鹽晶過程中，濃縮形成的高濃度的海水）開展鹵蟲毒性研究的報告較少?，F開展3種消毒劑對鹵蟲早期幼體毒性的研究，利用概率單位法估算3種消毒劑的半致死濃度與安全濃度，以期為南方沿海鹵蟲養殖及海水增養殖中合理使用消毒劑提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗地點與材料

試驗地點位于湛江嶺南師范學院水生動物實訓基地內。所用鹵蟲休眠卵由湛江海神生物科技發展有限公司提供，鹵蟲卵化時間28～30 h，孵化溫度27℃，光照2 000 lx，鹽度3.0%，ρ（溶解氧）＞7 mg/L，孵化密度0.5 g/L，全程持續增氧。孵化鹵水來自湛江坡頭區南三島南三鹽場，鹵水鹽度5.8%，釋稀鹽度至3.0%使用。試驗用水進行過濾、消毒、曝氣、沉淀、增氧處理。孵化前淡水浸泡30 min左右，08：00開始孵化，次日12：00于恒溫光照培養箱中開始毒理試驗。容器為直徑11 cm、高3 cm的圓柱形食品級塑料桶，有效水體積200 mL。試劑為KMnO分析純，有效含量99.9%）、HCHO（分析純，質量分數37%）、TCCA（三氯異氰脲酸粉TCCA，含有效氯30%）。溶液的配制方法為：用天平稱取一定質量的KMnO、TCCA，用去離子純凈水配制KMnO母液質量濃度1 g/L（現用現配）、TCCA母液質量濃度1 g/L（現用現配），定容500 mL，HCHO溶液濃度直接配制。

1.2 試驗設計

按水生動物毒理學試驗方法開展預試驗。按等比間距設置濃度區間，找到3種消毒劑對鹵蟲的24 h全死亡濃度和48 h全存活濃度，再根據濃度區間上下限按等對數間距設置濃度梯度，開展正式試驗。KMnO濃度區間為1.00～256.00 mg/L，HCHO濃度區間為800.00～6 400.00 mg/L，TCCA濃度區間為16.00～128.00 mg/L。1個濃度梯度設置3個平行組，1種消毒劑設置3個對照組，每組放鹵蟲幼體30只。試驗開始后不充氣、不換水、不投喂。分別于6，12，24，48 h觀察幼蟲的存活狀態，統計死亡幼體數量并用吸管吸出死亡幼體，計算所有試驗組的平均死亡數。毒性試驗重復2次。死亡鹵蟲幼體判斷標準為幼體沉于底部，且碰觸其附肢10 s沒有反應。

1.3 數據分析

用SPSS 21.0軟件處理數據，建立概率單位-質量濃度的直線回歸方程，并繪制出根據模型擬合的毒性預測回歸曲線，估算KMnO、HCHO、TCCA對鹵蟲幼體的24和48 h半致死濃度值（LC及95%置信區間。試驗中對照組出現死亡的數據利用SPSS概率回歸分析中的校正功能進行校正，做回歸直線擬合，在自然響應頻率選項Value值中填入對照組死亡數。安全濃度（SC）計算公式：

2 結果與分析

2.1 消毒劑對鹵蟲的毒性

試驗中發現鹵蟲對3種消毒劑的中毒癥狀不完全一致。鹵蟲接觸低濃度消毒劑6 h后，死亡數量很少，大部分個體活動正常，與對照組無明顯差異；12 h后，部分個體表現出游動緩慢，趨光性減弱，附肢擺動頻率變慢等現象；24 h后，部分個體沉入水底，附肢有微微擺動，少量個體已經死亡。3種消毒劑對鹵蟲毒性試驗結果見表1。由表1可見，隨著消毒劑濃度的提高，鹵蟲死亡數量明顯上升，在試驗的起始濃度時，鹵蟲24和48 h均無死亡個體；在最終濃度時，鹵蟲24 h死亡率均達到100%。配對樣本雙側檢驗表明，每種消毒劑的24與48 h平均死亡數存在顯著差異（＜0.05）。

表1 3種消毒劑對鹵蟲毒性試驗結果

2.2 概率單位回歸分析

2.2.1 擬合回歸方程

用概率單位法分析擬合KMnO、HCHO和TCCA對鹵蟲急劇毒性影響的線性回歸方程如下?；貧w方程Pearson擬合優度檢驗值均大于0.15，說明模型擬合較為理想。式中：PROBIT為對應的概率單位應變量值；lg（濃度）為對應藥物濃度的對數。

2.2.2 LC和SC估算

通過以上擬合的回歸方程估算LC及濃度95%的置信區間，求得3種消毒劑的SC。LC通過SPSS分析中概率單位法計算得到。KMnO對鹵蟲幼體的24和48 h LC為21.333和9.003 mg/L；HCHO對鹵蟲幼體的24和48 h LC為2 698.019和1 671.508 mg/L；TCCA對鹵蟲幼體的24和48 h LC為45.217和33.788 mg/L；KMnO、HCHO和TCCA的SC分別為0.481，192.467和5.660 mg/L。根據SC大小來確定敏感的順序，SC越小，越敏感。鹵蟲幼體對3種消毒劑的敏感度從高到低依次為KMnO、TCCA、HCHO。

3 討論

本試驗設計方案及試驗結果，均符合水生生物急劇毒性試驗質量控制要求，對照組死亡率≤10%；試驗組中有≤37%和≥67%組存在；試驗需設置至少5個及上的濃度梯度；用相同配制的溶液、相同的試劑、相同的操作方法得到的2次重復試驗結果之比小于2。

LC的計算方法較多，國內普遍采用的方法有3種，即改良寇氏法、概率單位法（Bliss法）和線性回歸法。本試驗通過Bliss法研究3種消毒劑對鹵蟲的毒性效應，擬合回歸直線求得LC與SC，進一步提高試驗結論的準確性與可信度。

3.1 KMnO4對早期鹵蟲幼體的急劇毒性效應

KMnO為一種強氧化劑，在水產養殖上應用廣泛。KMnO通過與有機體接觸，快速氧化酶蛋白及其中的活性基團（如-SH巰基團等），因此常用來給有效水體殺菌、消毒，去除原生動物等，但高濃度的KMnO會導致水生動物死亡。目前，關于KMnO對水生動物的毒性研究報道較多，多種水生動物的KMnOSC已經用于指導實踐。如凡納濱對蝦、斑節對蝦和中國龍蝦的KMnOSC分別為0.28，0.48和1.32 mg/L，雙齒圍沙蠶和中華絨螯蟹的SC分別為1.40和0.15 mg/L。于利等研究了KMnO等消毒劑對山西兩性鹵蟲不同發育時期的影響，表明鹵蟲對KMnO的SC≤1 mg/L。本研究得到KMnO對鹵蟲幼體的24和48 h LC分別為21.333和9.003 mg/L，KMnOSC為0.481 mg/L，與于利等及其他水生動物指導SC相近。

3.2 HCHO對早期鹵蟲幼體的急劇毒性效應

HCHO是一種廣譜殺菌消毒劑，主要是通過烷基化反應使蛋白質變性，從而來殺滅病原微生物，對細菌、芽孢、真菌及原生動物均有較強的殺滅作用，持續時間較其他消毒劑長，在水產養殖中常應用于受精卵、幼體、蝦苗及鹵蟲無節幼體等的消毒，育苗水處理以及原生動物等寄生蟲病害的防治等，對凡納濱對蝦和斑節對蝦仔蝦的SC為2.62和3.56 mg/L。生產中用150~200 mg/L的HCHO消毒對蝦無節幼體，浸泡30~60 s，用于防治日本囊對蝦等養殖中出現的鐘形蟲及聚縮蟲病。在鹵蟲孵化過程中，可用HCHO對收集的無節幼體進行消毒。陳婕研究HCHO對美國舊金山大鹽湖鹵蟲I期幼體的毒性效應，得到24 h LC為1 590 mg/L。張文博等以美國大鹽湖的鹵蟲為受試生物，評估HCHO對水環境的毒性，24和48 h LC為16.765和4.783 mg/L。本研究中，HCHO對鹵蟲幼體的24和48 h LC為2 698.019和1 671.508 mg/L，SC為192.467 mg/L，高于陳婕、張文博等的研究結果。這可能是由于不同產地鹵蟲遺傳多樣性不同，對脅迫因子的耐受性也不同。此外，試驗條件（水質、光照、鹽度、pH值等），試驗鹵蟲活動狀態和挑選試驗鹵蟲的隨機性等都是引起結果差異的原因。在鹵蟲養殖上，可參考HCHO SC不超過192.467 mg/L的標準對水體進行消殺，以預防病原微生物感染。

3.3 TCCA對早期鹵蟲幼體的急劇毒性效應

TCCA是一種有效含氯濃度達30%的廣譜殺菌消毒劑，對細菌、真菌、芽孢、病原微生物及病毒均有高效的殺滅作用，在多種水產動物的人工繁育及養殖中應用廣泛。羅氏沼蝦仔蝦SC為0.124 mg/L，凡納濱對蝦幼蝦SC為0.15 mg/L。含氯消毒劑在池壁消毒、水體病原微生物殺滅的應用中，效果顯著。研究表明，含氯消毒劑、聚維酮碘和碘液（2%）對卵子表面消毒效果均較好，而且不降低卵子活性，但以含氯消毒劑的效果最佳。劉淇等研究得到TCCA對鹵蟲無節幼體的SC為0.79 mg/L。王興林研究得到有效氯對鹵蟲幼體24和48 h LC為2.88和1.99 mg/L，SC為0.097 mg/L。本研究得到TCCA的SC為5.660 mg/L，顯著高于劉淇等和王興林的研究結果。引起結果差異的原因較多，劉淇等所用含消毒劑的有效氯含量為88%，而王興林試驗過程中每間隔24 h 100%更換試驗海水，有效氯含量和SC的計算方法不同是分別是導致結果差異的主要原因。因此，可參考不同條件下的TCCA消毒SC，既可以殺滅大多數細菌和病原體，又不影響鹵蟲幼體生長。