凱里米酸湯揮發性成分HS-SPME-GC-MS和HS-GC-IMS分析

嚴紅光，張建煬，林莉，袁華偉

1(宜賓學院 質量管理與檢驗檢測學部，四川 宜賓，644001)2(黔東南苗族侗族自治州食品藥品檢驗檢測中心， 貴州 凱里，556011)3(凱里學院 大健康學院，貴州 凱里，556011)

凱里酸湯源于貴州黔東南苗族傳統食品，包括糯米米湯為主要發酵原料的米酸湯(又稱為白酸湯)和西紅柿、辣椒為主要發酵原料的紅酸湯[1]。凱里酸湯主要的發酵菌為乳桿菌以及明串珠菌、醋酸桿菌、產朊假絲酵母、畢赤酵母[1-2]。凱里酸湯具有調控血脂代謝，降低血甘油三脂、血膽固醇及升高高密度脂蛋白的作用[3]。米酸湯發酵后富含有機酸、氨基酸、礦物質元素、維生素等，具有較好的抗氧化能力[1-2]。用于米酸湯發酵的乳酸菌也具有緩解和預防腹瀉、高血壓、糖尿病和便秘[2-3]等生理功效。

揮發性成分是構成食品風味品質的重要物質，也是消費者喜好的決定因素之一。食品中的揮發性成分可以采用氣相色譜質譜聯用法(GC-MS)[4]、電子鼻法[5]、氣相色譜離子遷移譜法(gas chromatography-ion mobility spectrometry，GC-IMS)[6]、氣相色譜嗅覺測量法[7]等研究。米酸湯風味獨特，王思婷等[4]、田亞等[8]采用頂空固相微萃取結合氣質聯用(headspace-solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS)分別分析出米酸湯40種和109種揮發性物質成分。LIU等[9]分析了凱里周邊地區10家企業和作坊的米酸湯產品風味物質，共鑒定出42種揮發性物質。WANG等[10]研究后發現不同白酸湯產品受工藝影響，風味物質差異顯著。由于GC-MS存在檢測時間長、前處理程序影響大、離子峰解譜較困難[11]，GC-IMS具有樣品前處理簡單、較好保留自身風味物質、小分子物質分辨率高等特點[12]，因此有必要采用多種揮發性物質檢測方法協同分析凱里米酸湯揮發性物質成分。

本文采用HS-SPME-GC-MS和HS-GC-IMS協同分析代表性凱里米酸湯產品揮發性物質成分。研究結果有利于加深對米酸湯揮發性風味物質成分認識，拓展GC-IMS技術應用范圍，為最終改進凱里米酸湯風味品質提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料和試劑

凱里地區3家著名企業各自剛結束乳酸發酵階段的1個米酸湯批次。這3家企業分別是貴州省非物質文化遺產傳承人創辦企業、市場規模暫居最大的企業和具有三十余年創辦歷史的企業。隨機選擇每家企業9個發酵壇，在每個壇子中部50 cm處各自取樣50 mL。每3個壇子取的樣混勻為1個待測樣品。每家企業制備出3個待測樣品，-20 ℃貯存。3家企業樣品依次編為MC、NH、YM。

標準品：乙酸乙酯(99.9%)、丙酸乙酯(99.5%)、丙酸丙酯(99.5%)、乙醇(99.8%)、正丙醇(99.9%)、異戊醇(99.8%)、仲辛醇(99.5%)、乙酸(99.8%)、丙酸(99.5%)、己酸(99.5%)、辛酸(99.5%)、壬酸(99%)，上海阿拉丁生化科技股份公司；C7-C40正構烷烴標樣，美國o2si公司。

1.2 主要儀器

配置全自動頂空進樣裝置的FlavourSpec?風味分析儀，德國G.A.S.公司；PR124ZH電子天平，美國OHAUS公司；Agilent 7890A-5975C氣相色譜-質譜聯用儀，美國Agilent公司；配置磁力加熱攪拌裝置的固相微萃取操作平臺、50/30 μm DVB/CAR/PDMS 萃取頭及聯用手柄57356U，美國Supelco公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 HS-SPME-GC-MS測定揮發性成分

準確量取8 mL米酸湯樣品置于15 mL頂空瓶中，加入磁性轉子、1.5 g NaCl、8 μL 4.095 g/L的仲辛醇內標溶液，立即用聚四氟乙烯墊封口。樣品在固相微萃取操作平臺上40 ℃平衡15 min，再用老化后的萃取頭頂空萃取25 min，隨后手動進樣，250 ℃解析8 min。

GC-MS條件：HP-INNOWax氣相色譜柱(60 m×0.25 mm, 0.25 μm, 美國J&W公司)。前進樣口溫度250 ℃，載氣(He) 流速1.0 mL/min，不分流進樣。程序升溫：40 ℃保持3 min，以3 ℃/min升至150 ℃，以10 ℃/min升至230 ℃并保持5 min。色譜-質譜接口溫度280 ℃，EI電離源，離子源溫度230 ℃、電壓70 eV；掃描范圍m/z35-500。

1.3.2 HS-GC-IMS測定揮發性成分

準確量取1 mL米酸湯樣品置于20 mL頂空瓶，孵化轉速500 r/min，45 ℃下孵育15 min后進樣。

GC-IMS分析條件：色譜柱WAX 30 m ID 0.53 mm，柱溫60 ℃，載氣/漂移氣均為≥99.999%氮氣，IMS溫度45 ℃，分析時間30 min。自動進樣體積100 μL，進樣針溫度50 ℃。

氣相色譜條件：0～2 min：漂移氣150 mL/min，載氣2 mL/min；2～20 min：漂移氣150 mL/min，載氣2 mL/min提升至100 mL/min；20～30 min：漂移氣150 mL/min，載氣100 mL/min。

1.4 米酸湯揮發性成分定性定量分析

HS-SPME-GC-MS定性分析方法:在標準信息庫NIST 17.0中檢索比對物質峰質譜信息，在匹配度≥70%條件下，結合RI值、標準品比對進行定性。

HS-SPME-GC-MS定量分析方法:采用內標半定量方法。根據各揮發性成分及仲辛醇峰面積的比值，按公式(1)計算出揮發性成分質量濃度：

(1)

式中:Ci，揮發性成分質量濃度，mg/L;Ai，揮發性成分峰面積;Ais，內標物峰面積;Vi，樣品體積，L;mis，內標物質量，mg。

氣味活度值(odor activity value, OAV) 計算方法:查閱出揮發性成分閾值，利用揮發性成分濃度與閾值的比值，按公式(2)計算：

(2)

式中:Ci，揮發性成分質量濃度，mg/L;Ti，該揮發性成分閾值，mg/L。

HS-GC-IMS定性分析方法:通過GC-IMS數據分析軟件LAV查看分析圖譜，利用Reporter插件比較二維和三維圖譜差異，利用Library Search軟件和儀器內置NIST、IMS數據庫進行揮發性物質成分定性分析。

1.5 數據處理

利用GC-IMS的Gallery Plot插件進行不同米酸湯樣品間揮發性成分含量差異比較，Dynamic PCA插件進行主成分分析。

2 結果與分析

2.1 凱里米酸湯HS-SPME-GC-MS分析結果

凱里米酸湯樣品揮發性成分HS-SPME-GC-MS定性和半定量分析結果見表1。3種米酸湯樣品一共鑒定出28種揮發性物質，包括10種醇類、10種酯類、3種酸類、1種酮類、1種呋喃類、2種醚類、1種酚類。3種米酸湯樣品揮發性成分組成均以醇類、酯類和酸類化合物為主，這與前人對米酸湯揮發性成分研究結論較吻合[9]。3個代表性廠家米酸湯樣品揮發性物質組成不一致。其中MC樣品鑒定出23種揮發性物質、NH樣品檢測出21種、YM樣品分析出18種。3個生產廠家產品中，只有乙酸乙酯、丁酸乙酯這2種揮發性物質成分的濃度差異不顯著，且8種揮發性物質成分只出現在其中一家產品中，為正丙醇、正己醇、2-壬醇、苯乙醇、乙酸丁酯、丁酸丁酯、2-甲基呋喃、乙二醇乙醚。3家企業生產用發酵容器材質和規格、發酵溫度、發酵時間、老水來源及配比、釀造用水和糯米等原輔料組成比例都有一定差異，可能是造成產品揮發性物質組成不同的原因[8,13]。

表1 不同米酸湯樣品揮發性物質成分含量Table 1 Content of volatile component in different rice sour soup samples

表2的OAV可用于分析揮發性成分對風味貢獻程度。OAV<1表示該成分質量分數低于閾值，具有修飾米酸湯風味作用；OAV≥1時，該成分對米酸湯整體風味特征具有較大貢獻。由表2可見，YM樣品中OAV≥1的特征香氣成分有乙醇(2.43)、仲丁醇(1.82)、異戊醇(328.37)、正己醇(1.38)、2-壬醇(16.67)、乙酸乙酯(3136.85)、丙酸乙酯(28.35)、乙酸丙酯(30.59)、丁酸乙酯(444.93)、丙酸丙酯(218.57)、丁酸丙酯(19.92)、乙酸(3.26)、丙酸(15.98)、仲辛酮(7.29) 和2,4-二叔丁基苯酚(109.79)。NH樣品中OAV最大的是乙酸乙酯(2 958.89)，其次是丁酸乙酯(351.06)、異戊醇(99.31)、2，4-二叔丁基苯酚(69.93)、丁酸丙酯(49.56)、二烯丙基硫醚(33.48)、正丁醇(25.51) 和仲丁醇(19.46)，這些物質對香氣輪廓形成起決定性作用。MC樣品中OAV最大的是乙酸乙酯(2 694.08)，其次是丁酸乙酯(411.64)、異戊醇(164.74)、丁酸丙酯(98.87)、2，4-二叔丁基苯酚(86.86)、正丁醇(44.31)、丁酸(29.24)和異辛醇(27.87)。

表2 不同米酸湯樣品揮發性物質成分閾值及OAVTable 2 Threshold and OAV of volatile component in different rice sour soup samples

由于醇類和酯類物質揮發性較強，閾值較低，OAV較大，因此其對3種米酸湯樣品風味都具有很大貢獻，同時也是凱里米酸湯中重要的風味化合物。米酸湯中酯類物質可以給整體風味特征帶來花果香，有助于改善香味復雜性[14]。其中乳酸乙酯具有水果和黃油的味道[14]；乙酸乙酯具有果香和洗甲水風味特征[15-16]，且在濃度低于150 mg/L時具有增強香氣吸引力的作用[16]；丁酸乙酯具有香蕉和青蘋果氣味[16]。正丁醇具有酚類香氣特征[16]；異戊醇具有動物皮毛和洗甲水風味特征[16-17]；正己醇具有青草香[16]；正丙醇會帶來辛辣香味[16]。樣品中還分析出少量酸類、醚類、酮類和酚類化合物，它們對凱里米酸湯風味形成具有一定的修飾作用。如乙酸具有醋味[16]，丁酸能增強酸敗的氣味[18]。

從表2還可以看出，米酸湯YM樣品中，丁酸、乙酸丁酯、丁酸丙酯和丁酸丁酯含量比MC樣品低，而丙酸、丙酸乙酯和丙酸丙酯含量比MC樣品高。這些物質對香氣輪廓形成起重要作用，且可能提示不同米酸湯樣品中發酵微生物代謝產酸類型不相同。前人研究發現，米酸湯發酵過程中存在乳酸菌、醋酸菌、畢赤酵母菌等觸發的多種發酵形式，影響了酸湯有機酸代謝和風味特征[1-2]。

2.2 凱里米酸湯HS-GC-IMS分析結果

2.2.1 不同米酸湯樣品揮發性成分差異

利用HS-GC-IMS分析3個具有代表性米酸湯企業產品揮發性成分，根據揮發性成分的物質峰保留時間、遷移時間及物質峰強度可以生成三維圖譜。三維圖譜經投影后獲得的二維俯視圖如圖1所示。選取米酸湯MC樣品氣味指紋圖譜作為參比，其他兩種樣品圖譜扣除參比。圖1中白色部位表示揮發性成分濃度與參比樣品相同，紅色代表該成分濃度高于參比樣品，藍色代表該成分濃度低于參比樣品。每個樣品的圖譜代表其頂空中所有揮發性成分。由圖1及方框指示位置可知，從左至右依次顯示的MC、NH和YM米酸湯樣品揮發性成分差異明顯。

圖1 不同米酸湯樣品揮發性物質成分二維氣相 離子遷移圖譜Fig.1 Two-dimensional GC-IMS image of different rice sour soup samples 注:縱坐標為保留時間，橫坐標為遷移時間，紅色豎線為反應離子峰

2.2.2 不同米酸湯樣品揮發性成分HS-GC-IMS定性分析

利用外標正酮C4～C9計算揮發性物質保留指數，與GC-IMS內置NIST、IMS數據庫信息進行定性比對，結果見表3。3種米酸湯樣品中共定性識別出33種揮發性物質成分，包括6種醇類、14種酯類、5種醛類、4種酮類、3種酸類、1種呋喃類。由于內置數據庫正在完善中，因此圖1中部分揮發性物質成分未能識別。

表3 米酸湯樣品GC-IMS圖譜揮發性物質成分定性結果Table 3 Qualitative result of volatile component in the GC-IMS image of rice sour soup samples

2.2.3 不同米酸湯樣品揮發性成分指紋圖譜分析

利用GC-IMS的Gallery Plot插件比對不同米酸湯樣品揮發性成分物質含量差異，利用所有樣品二維圖譜待分析峰構建指紋圖譜(圖2)。從圖中可以直觀識別每種樣品完整揮發性成分信息以及樣品間揮發性成分物質含量差異。

從指紋圖譜中可知，不同米酸湯樣品有共同的揮發性物質成分和各自的特征物質峰。凱里米酸湯樣品共同含有的揮發性物質成分主要包括乙酸乙酯、乙酸丙酯、丙酸乙酯、乙醇、正丙醇、正丁醇、異丁酮等7種。米酸湯MC樣品的主要特征物質包括乙酸丁酯、乙酸異丁酯、乙酸異戊酯、2-甲基丁酸甲酯、2-甲基丁酸乙酯、丁酸丙酯、己酸甲酯、異丙醇、正戊醇、3-戊酮等10種;米酸湯NH樣品的主要特征物質包括異辛醇、2-乙基呋喃、丁酸乙酯、乙酸異丙酯、甲酸乙酯、乳酸乙酯、E-2-己烯醛、2,3-戊二酮、丙酮等9種，米酸湯YM樣品的主要特征物質包括異丁酸、丙酸、正丁醛、乙酸丁酯等4種。從指紋圖譜中還發現3種未能定性的揮發性物質成分，這是由于GC-IMS內置NIST數據庫信息限制導致。凱里米酸湯主要釀造原料為本地產禾糯米，含有淀粉、氨基酸、B族維生素、脂肪酸等，發酵前需要將原料進行高溫蒸煮[20]。前人研究認為：脂肪酸酶解之后可以產生揮發酸，帶來水果、脂肪、奶酪和酸敗的味道，而醋酸酯可以由乙酰輔酶A和醇通過一系列反應代謝產生[18]。醇類物質代謝產生途徑包括氨基酸的降解、不飽和脂肪的降解或醛類物質還原反應[16]，而酯類揮發性物質一般通過酸和醇的脫水-縮合反應形成[21]。樣品中檢測到的2-乙基呋喃屬雜環化合物，可以通過糖裂解、硫胺素降解及美拉德反應產生[12]。

圖2 不同米酸湯樣品揮發性物質成分指紋圖譜Fig.2 Volatile component fingerprint of different rice sour soup samples 注：Y軸為樣品編號；X軸為米酸湯樣品全部揮發性成分物質信號峰；已定性物質用名稱表示；未定性物質用編號表示； 物質峰顏色越深代表相對含量越大

2.2.4 不同米酸湯樣品揮發性成分主成分分析

為直觀比較3種代表性凱里米酸湯產品揮發性成分差異，使用Dynamic PCA插件程序制作主成分分析圖，結果見圖3。PC1和PC2的貢獻解釋了總變異的98%，且3種米酸湯樣品能很好分離，證明了樣品特征性風味物質具有一定差異。選取所有樣品的揮發性成分物質峰進行主成分分析，其中分布在主成分分析圖右下角黑色圓點為MC樣品，樣本間聚集度較高；左下角藍色圓點為NH樣品，樣本間聚集度一般；上方中間位置紅色圓點為YM樣品，樣本間聚集度較均勻。GC-IMS技術可對不同凱里米酸湯產品進行有效區分。

圖3 不同米酸湯樣品主成分分析結果Fig.3 Principal component analysis of different rice sour soup samples

2.3 米酸湯樣品揮發性成分HS-SPME-GC-MS和GC-IMS分析差異

表1和表3分別列出HS-SPME-GC-MS和HS-GC-IMS鑒定出的3種代表性米酸湯產品主要揮發性物質成分28種和33種。通過比對發現，2種分析技術共同檢測出的揮發性物質成分為13種，多為醇、酯、酸類等化合物。3種米酸湯樣品在2種檢測方法中都檢出乙酸乙酯、丙酸乙酯、乙酸丙酯、丁酸乙酯、丁酸丙酯、乳酸乙酯、乙醇和丙酸8種風味物質；MC和NH米酸湯樣品在2種檢測方法中都檢出正丁醇、異丙醇、異辛醇3種風味物質；MC米酸湯樣品在2種檢測方法中都檢出乙酸丁酯、正丙醇2種風味物質。通過對比還可以發現，米酸湯樣品中只被HS-GC-IMS鑒定出的揮發性物質為己酸甲酯、乙酸異戊酯、2-甲基丁酸乙酯、乙酸異丁酯、2-甲基丁酸甲酯、乙酸異丙酯、甲酸乙酯、正戊醇、2-甲基丁醛、丙醛、2-己烯醛、正丁醛、糠醛、異丁酮、2,3-戊二酮、丙酮、3-戊酮、2-乙基呋喃、異丁酸和2-甲基丁酸。只被HS-SPME-GC-MS鑒定出的揮發性物質為丙酸丙酯、領苯二甲酸二丁酯、仲丁醇、異戊醇、正己醇、2-壬醇、苯乙醇、仲辛酮、2-甲基呋喃、二烯丙基硫醚、乙二醇乙醚、乙酸、丁酸、2,4-二叔丁基苯酚。2種分析方法中，GC-IMS鑒定出相對更豐富的酯類、醛類、酮類化合物。這可能是由于其前處理條件以及GC-IMS的2次分離效果，導致GC-IMS結果中特異性揮發物質總數增加[12]。采用2種技術手段協同分析，可以獲得3種凱里米酸湯中更加全面的揮發性風味物質成分信息。

3 結論

為研究凱里米酸湯3個代表性產品揮發性風味物質特征，采用頂空固相微萃取-氣質聯用和頂空氣相色譜-離子遷移譜兩種技術方法對其進行分離鑒定。采用HS-SPME-GC-MS技術分析出28種揮發性物質。與米酸湯MC樣品比較，YM樣品中，丁酸、乙酸丁酯、丁酸丙酯和丁酸丁酯含量較低，而丙酸、丙酸乙酯和丙酸丙酯含量較高。不同廠家米酸湯產品有機酸及其衍生揮發性物質組成差異顯著。下一步可以研究凱里米酸湯發酵微生態環境條件參數對優勢菌株及其代謝產生主要揮發性物質動力學規律影響，以提升產品品質特征。采用HS-GC-IMS技術分析出33種揮發性成分，其中13種揮發性成分與GC-IMS鑒定結果一致。由于GC-IMS對揮發性物質的高分離特性，同時應用HS-GC-IMS和HS-SPME-GC-MS技術可以獲得米酸湯揮發性成分更完整的信息。GC-IMS指紋圖譜表明：樣品揮發性成分特征明顯；主成分分析表明3種凱里米酸湯樣品間風味差異大，并能分別聚成一類。GC-IMS技術可以有效識別不同來源米酸湯產品，但該分析結果中部分揮發性物質成分尚未能夠被定性。因此，下一步有必要將HS-GC-IMS應用于SPME技術并繼續完善NIST和IMS數據庫信息，以提高其利用價值與應用范圍。