益生菌發酵豆乳對提高結合態大豆異黃酮轉化的效果

李潔，魯皓，劉柳，吳曉霞，李成，丁聰，李建科*

1(陜西師范大學 食品工程與營養科學學院，陜西 西安,710119)2(陜西秦豆園農業科技有限公司，陜西 咸陽,721000)

大豆富含維生素、異黃酮、蛋白質、膳食纖維及不飽和脂肪酸等營養物質，是人類主要的植物蛋白來源之一[1]。豆乳是大豆經過加工后獲得的一種飲料，因其具有獨特的風味、營養物質豐富且易吸收而深受大眾喜歡。對于營養不良的人群以及牛奶供應不足的人群來說，豆乳蛋白的營養價值高且更容易被人體吸收[2]。益生菌為一類對機體有益的活性微生物，可以平衡機體腸道內菌群，同時也可以產生活性物質，促進人體健康[3]。乳酸菌是一類存在于人體胃腸道中的多效益生菌，可以降低膽固醇水平，具有抵抗低酸堿度和高膽鹽的能力，研究價值非常高[4]。發酵豆乳由滅菌豆乳經過益生菌發酵而形成，其具有豆香味，保留了豆乳原有營養價值的同時減少了高脂飲食引起的高脂血癥和肝損傷[5]，可改善低聚糖的消化率[6-7]，同時減少草酸、植酸、蛋白酶抑制劑、脲酶等抗營養成分[8-9]。此外，通過益生菌的發酵，可將結合型的大豆異黃酮轉化為更易被人體消化吸收的游離型大豆異黃酮[10-11]。大豆異黃酮被稱為天然植物雌激素，雖然對機體健康有益，但主要是以結合態的大豆異黃酮存在，即為糖苷形式，難以被人體消化吸收[12]。當人體攝入含有大豆異黃酮的食物后，游離型的大豆異黃酮可直接在小腸被吸收，而結合型的大豆異黃酮則在腸道中被β-葡萄糖苷酶水解，轉化成游離型的苷元從而被機體消化吸收，因此游離型的大豆異黃酮消化吸收率更高[13]。同時其在預防骨質疏松、心血管疾病、神經保護和抗腫瘤等疾病方面有一定的生理功效。并且大豆異黃酮苷元具有較高的市場價格，因此提高豆類食品中苷元類物質的含量，增加大豆異黃酮資源的利用度，對保健食品的開發具有重要意義。

本實驗為探究益生菌在全豆乳發酵中對結合態大豆異黃酮的轉化，以干酪乳桿菌(Lacticaseibacilluscasei)、嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)、植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)分別發酵全豆乳，以發酵豆乳的pH值降到4.5為發酵終點，測定發酵期間pH值、滴定酸度、活菌數、表觀黏度、游離氨基氮和大豆異黃酮含量的變化，并對發酵產品進行感官評價，為益生菌發酵豆乳的研究提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 材料與試劑

干酪乳桿菌(Lacticaseibacilluscasei)CICC 23488、植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)CICC 22696，中國工業微生物菌種保藏管理中心；嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)BNCC 185342，北納創聯生物技術研究院；MRS肉湯、MRS固體培養基，北京奧博星生物技術有限責任公司；乙腈、甲醇和甲酸均為色譜純，天津市大茂化學試劑廠；大豆苷、大豆苷元、染料木苷和染料木素標準品均為HPLC級，西安晶博生物科技有限公司，含量≧98%。實驗所有水均為由Q-Grad?超純水系統制備的超純水(18.2 MΩ)；其他試劑均為分析純及以上級別，Sigma-Aldrich。

全豆乳產品，陜西秦豆園農業科技有限公司生產并提供。

1.1.2 儀器設備

HWS智能型恒溫恒濕培養箱，寧波江南儀器廠；HaierBCD-206T冰箱，青島海爾股份有限公司；VisionPlus pH6178 pH劑，安徽賽科環保科技有限公司；YUEJIN超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術有限公司；SHIMADZU高效液相色譜，島津企業管理(中國)有限公司；TGL-16 gR高速離心機，上海安亭科學儀器廠；KQ-250DB型數控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；BROOKFIELD DV-E型黏度計，上海一恒科技有限公司；立式壓力蒸汽滅菌器，上海博訊實業有限公司醫療設備廠。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株活化與菌懸液制備

將-80 ℃保存的L.casei、L.acidophilus和L.plantarum分別培養在MRS肉湯培養基中，37 ℃，12 h。為了確保益生菌生長活力達到良好的狀態，按照活化培養液體積分數為3%的接種量連續傳代3次。每次使用前各菌株均在MRS肉湯培養基中活化2代。以上操作均在超凈工作臺中完成。取10 mL活化培養的種子液制成108CFU/mL菌懸液。

1.2.2 全豆乳的制作工藝

選料篩選(精選非轉基因大豆，顆粒飽滿)→浸泡、煮豆→制漿→均質→罐裝→殺菌(超高溫、短時連續殺菌)→冷卻→4 ℃保藏

1.2.3 發酵全豆乳的制備

取300 mL按1.2.2制作的全豆乳平均分裝于3個無菌錐形瓶中，按照3%(體積分數，下同)接種量分別將L.casei、L.acidophilus和L.plantarum接種于分裝的全豆乳中，用無菌玻璃棒攪拌均勻，37 ℃條件下發酵至終點，將發酵好的全豆乳于4 ℃冷藏備用。

1.2.4 益生菌在全豆乳中的發酵特性及活性物質的含量變化

取300 mL全豆乳平均分裝于3個無菌錐形瓶中，以3%接種量分別將L.casei、L.acidophilus和L.plantarum接種于分裝的全豆乳中，用無菌玻璃棒攪拌均勻，37 ℃恒溫恒濕培養，每隔2 h取樣測定其pH值、滴定酸度、表觀黏度直至發酵結束(pH 4.5)，測定發酵豆乳活菌數、游離氨基氮、大豆異黃酮含量。

1.2.4.1 主要理化指標的測定

水分的測定參考GB 5009.3—2016《食品安全國家標準 食品中水分的測定》，以直接干燥法進行測定；灰分的測定參考 GB 5009.4—2016《食品安全國家標準 食品中灰分的測定》，以灼燒重量法進行測定；脂肪含量的測定參考GB 5009.6—2016《食品安全國家標準 食品中脂肪的測定》，以索氏抽提法進行測定；蛋白質含量的測定參考GB 5009.5—2016《食品安全國家標準 食品中蛋白質的測定》，以凱氏定氮法進行測定。

pH值用pH計在室溫下檢測；滴定酸度：準確稱取發酵全豆乳樣品5 g于100 mL錐形瓶中，加入40 mL超純水，用玻璃棒攪拌均勻，加入2～3滴酚酞指示劑，用0.1 mol/L NaOH溶液滴定至微紅色且30 s內顏色不消失。滴定酸度(吉爾涅爾度°T)為100 mL發酵豆乳消耗 0.1 mol/L NaOH的體積(mL)。消耗1 mL 0.1 mol/L NaOH相當于1 °T。

表觀黏度使用BROOKFIELD DV-E型黏度計測定發酵全豆乳黏度；游離氨基氮參考CHURCH等[14]的方法，用鄰苯二甲醛衍生比色法測定。

1.2.4.2 活菌計數

取一定量的發酵全豆乳，用無菌水進行梯度稀釋，然后選取稀釋10-5、10-6、10-7倍的發酵全豆乳用平板傾注法測定活菌數。37 ℃倒置培養24～48 h，記錄菌落總數，用CFU/mL表示。

1.2.4.3 感官評定

參照文獻[15]的方法，邀請從事食品研究的人員男女各5名進行感官評定，每次品嘗需在口中細細品味5 s以上并用舌頭攪動發酵全豆乳。分別從組織狀態、氣味、口感和質地打分，每次品嘗前需充分漱口，評分標準見表1。

表1 感官評分表Table 1 Sensory evaluation standard

1.2.4.4 發酵豆乳中大豆異黃酮含量的測定

參照 GB/T 23788—2009《保健食品中大豆異黃酮的測定方法 高效液相色譜法》。

樣品預處理：取發酵豆乳5 mL于50 mL容量瓶，加入80%(體積分數，下同)甲醇溶液至接近刻度線，然后以100 W功率超聲振蕩40 min。超聲結束后用80%甲醇定容，搖勻。取適量樣品溶液以8 160 r/min離心15 min。將上清液過0.45 μm濾膜后備用。

HPLC色譜條件：色譜柱：ZORBAXSB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相A：乙腈；流動相B：0.5%甲酸超純水。流速1 mL/min；波長260 nm；進樣量20 μL；柱溫30 ℃。梯度洗脫程序見表2。

表2 梯度洗脫程序Table 2 Gradient elution procedures

1.2.5 數據分析

所有實驗至少重復3次，結果以“平均值±SD”表示。采用SPSS 15.0軟件對實驗數據進行統計學分析，Origin 7.0軟件繪圖。文中上標字母不同表示存在顯著性差異(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 全豆乳主要理化指標的測定結果

本實驗制備的全豆乳水分含量為81.49%，灰分、脂肪和蛋白質含量分別為1.15%、2.78%和4.35%。

2.2 三株益生菌對全豆乳的發酵特性

2.2.1 全豆乳發酵過程中pH值的變化

分別以L.casei、L.acidophilus和L.plantarum發酵全豆乳，每隔2 h測定發酵期間的pH值至發酵終點，結果如圖1所示。

圖1 三株益生菌發酵全豆乳pH值的變化Fig.1 Changes in pH value of whole soymilk fermented by three probiotics

L.casei和L.plantarum發酵全豆乳pH值下降的速度較快，而L.acidophilus發酵全豆乳在0～7 h時pH值下降緩慢，7～14 h時呈快速下降趨勢。其中，L.casei發酵全豆乳到達終點(pH 4.5)用時最短，為7 h；而L.acidophilus發酵全豆乳到達終點用時最長，為20 h，這可能是由于其蛋白水解能力較弱造成的。CHURCH等[14]用單一益生菌發酵豆乳，結果顯示達到發酵終點用時較長，與本研究所得結論基本一致。

2.2.2 全豆乳發酵過程中滴定酸度值的變化

由圖2可知，L.acidophilus發酵全豆乳在0～6 h時滴定酸度值變化緩慢，然后呈現快速上升趨勢。L.plantarum發酵全豆乳在發酵結束時滴定酸度值最高，為66.17 °T，與L.acidophilus發酵全豆乳滴定酸度值沒有顯著差異。而L.casei發酵全豆乳在發酵結束時滴定酸度值顯著低于其他益生菌發酵的樣品(P<0.05)，為32.83 °T。

圖2 三株益生菌發酵全豆乳滴定酸度值的變化Fig.2 Changes in titration acidity of whole soymilk fermented by three probiotics

2.2.3 全豆乳發酵過程中表觀黏度的變化

分別以L.casei、L.acidophilus和L.plantarum發酵全豆乳，每隔2 h測定發酵期間的黏度值至發酵終點，結果如圖3所示。

圖3 三株益生菌發酵全豆乳黏度的變化Fig.3 Changes in viscosity of whole soymilk fermented by three probiotics

3株益生菌發酵全豆乳黏度呈現快速上升趨勢，發酵結束時均在1.0～1.4 Pa·s，其中L.casei發酵全豆乳黏度略微高于其他益生菌，為1.397 Pa·s。L.casei發酵全豆乳表觀黏度在短時間內快速上升，這可能是由于益生菌的快速增殖使得乳酸含量升高，大豆蛋白凝固形成酸凝膠，導致黏度迅速增加[16]。其他2種菌發酵全豆乳的表觀黏度變化比較平緩，這與它們較長的發酵時間相吻合，表明這2種菌增殖速度相對較慢，相應的乳酸含量增加也較慢，表觀黏度也因此呈現平緩上升的趨勢。

2.2.4 全豆乳發酵起始和結束時的活菌數

發酵乳制品中活菌數須在106CFU/mL以上且能在腸道中存活才能發揮其益生特性[17]。由表3可知，發酵結束時，3株益生菌發酵全豆乳活菌數均顯著升高(P<0.05)，均>108CFU/mL。其中，L.casei發酵全豆乳到達發酵終點時活菌數最高為2.03×109CFU/mL。這可能是因為發酵過程中會產生一些碳源如水蘇糖、棉子糖、蔗糖、葡萄糖等，這些物質可作為發酵菌的能量來源，加速了發酵菌的生長增殖。

表3 發酵起始和結束時的活菌數 單位：lg CFU/mL

2.2.5 全豆乳發酵過程中游離氨基氮的變化

分別以L.casei、L.acidophilus和L.plantarum發酵全豆乳，測定發酵結束時的游離氨基氮的含量，結果如圖4所示。發酵結束時，L.acidophilus的蛋白質水解能力最強，其發酵結束時游離氨基氮的含量為3.09 mmol/L。而L.casei的蛋白質水解能力較其他2株菌弱，發酵結束時游離氨基氮的含量為2.39 mmol/L。其可能原因是發酵時間越長，全豆乳中大豆蛋白水解越徹底。菌株的類型和發酵時間可能影響蛋白水解的活性[18]。此結論與本研究結果基本一致。

圖4 三株益生菌發酵全豆乳游離氨基氮的變化Fig.4 Changes of free amino nitrogen in whole soymilk fermented by three probiotics

2.2.6 感官評定

圖5為發酵結束后于4 ℃冰箱貯藏12 h后全豆乳的感官評價結果。由圖5可知，L.casei發酵全豆乳感官評分最高，L.plantarum次之，L.acidophilus最低。L.casei發酵全豆乳具有外觀光滑緊致、色澤柔和、產品形狀保持較好的特點。雖有少量乳清析出，但酸甜比例適宜、口感細膩、無豆腥味、味道可口，符合大眾口味。因此，L.casei更適合發酵有良好口感的豆乳，開發出暢銷大眾的新產品。

圖5 三株益生菌發酵全豆乳感官評分Fig.5 Sensory scores of whole soymilk fermented by three probiotics

2.3 三株益生菌發酵全豆乳中大豆異黃酮的含量

2.3.1 原全豆乳中大豆異黃酮含量的測定

大豆異黃酮類物質中主要包括大豆苷、染料木苷、大豆苷元和染料木素等活性成分。通過益生菌發酵將大豆中糖苷形式的大豆異黃酮轉化為苷元形式的大豆異黃酮，可極大增加其消化吸收率。

如圖6所示，原全豆乳主要含大豆苷和染料木苷，含量分別為67.30、104.6 μg/mL，苷元和染料木素的含量較少，分別為3.13、2.43 μg/mL。這與大豆異黃酮中，苷元占2%～3%，糖苷占97%～98%的結果一致[12]。

圖6 原全豆乳中大豆異黃酮含量Fig.6 Soy isoflavone content in original whole soymilk

2.3.2 大豆苷和大豆苷元在全豆乳發酵期間的變化

由圖7-a可知，L.casei和L.acidophilus發酵全豆乳中大豆苷含量在發酵結束時顯著下降(P<0.05)，L.plantarum發酵全豆乳中大豆苷含量在發酵前后沒有顯著差異(P>0.05)。而圖7-b顯示3株益生菌發酵全豆乳中大豆苷元含量在發酵前后均顯著上升(P<0.05)。其中，L.casei發酵全豆乳中大豆苷元含量為6.23 μg/mL，是原全豆乳的2.0倍；L.acidophilus發酵全豆乳中大豆苷元含量為5.73 μg/mL，是原全豆乳的1.8倍；L.plantarum發酵全豆乳中大豆苷元含量最高，為9.59 μg/mL，是原全豆乳的3.1倍。說明L.plantarum能夠很好地分解糖苷型大豆苷，生成游離型的大豆苷元。

a-大豆苷含量；b-大豆苷元含量圖7 三株益生菌發酵全豆乳大豆苷和大豆苷元的變化Fig.7 Changes of daidzin and daidzein of whole soymilk fermented by three probiotics

2.3.3 染料木苷和染料木素在全豆乳發酵期的變化

由圖8-a可知，3株益生菌發酵全豆乳中染料木苷含量在發酵結束時均有下降，其中L.acidophilus發酵全豆乳中染料木苷含量下降最明顯，下降了13.1%。而圖8-b顯示，3株益生菌發酵全豆乳中染料木素的含量經發酵后顯著上升(P<0.05)，其含量分別增加到12.97、8.57、18.73 μg/mL，分別是原全豆乳的5.3、3.5、7.7倍。其中，L.plantarum發酵全豆乳中染料木素含量最高。這與發酵過程苷類物質水解為對應苷元物質的結論一致[19]。

a-染料木苷含量；b-染料木素含量圖8 三株益生菌發酵全豆乳染料木苷和染料木素的變化Fig.8 Changes of genistein and genistein of whole soymilk fermented by three probiotics

3 結論

本研究以L.casei、L.acidophilus和L.plantarum分別發酵全豆乳，以pH值降到4.5為發酵終點。發酵期間，3株益生菌發酵全豆乳pH值顯著下降，而滴定酸度和表觀黏度均顯著升高(P<0.05)。L.acidophilus發酵全豆豆乳到發酵終點用時最長，為20 h，大豆蛋白水解徹底，所以游離氨基氮含量最高，為3.09 mmol/L。發酵結束時，3株益生菌發酵全豆豆乳的活菌數均>108CFU/mL。

L.casei發酵全豆乳具有外觀光滑緊致、色澤柔和、產品形狀保持較好的特點。雖有少量乳清析出，但酸甜比例適宜，無豆腥味，味道可口，符合大眾口味，適合用于發酵出具有良好口感的豆乳。

發酵全豆乳大豆苷元、染料木素含量較原全豆乳中有顯著升高(P<0.05)。其中，L.plantarum發酵全豆豆乳中大豆苷元和染料木素含量最高，為9.59、18.73 μg/mL，分別是原全豆乳的3.1、7.7倍。因此L.plantarum發酵豆乳可顯著提高結合態大豆異黃酮的轉化效率，提高了游離態大豆異黃酮的含量，從而增加人體對大豆異黃酮的消化吸收率，具有更高的營養保健價值。