清香型小曲白酒釀造中酵母資源解析及其耐受性能研究

李群，林斌，唐潔，江威，朱麗萍，楊強，劉源才，陳申習

(勁牌有限公司 勁牌研究院，中藥保健食品質量與安全湖北省重點實驗室，湖北 大冶，435100)

酵母是白酒釀造中三大主要功能微生物類群之一，其在糖化和發酵過程中數量與種類不斷變化，促進了底物轉化為乙醇并形成多種香味物質[1-2]。在我國，由于地理環境和釀造工藝的不同使得白酒在發展中形成了多種香型，如清香型、濃香型和醬香型，從而導致酵母菌群的種類、分布也存在一定的差異[3-5]。相比于醬香和濃香型白酒，對清香型白酒中酵母種類研究較少，主要集中在釀酒酵母、漢遜酵母、東方伊薩酵母及假絲酵母等[6-8]。因此，從清香型白酒酒曲中篩選新的優良酵母是持續提升白酒出酒率和酒質的重要方法[9-11]。

近年來高通量測序技術在清香型小曲白酒釀造微生物的研究中獲得重要進展，為小曲白酒微生物的研究指明了方向[12-14]。但其無法獲得活的菌株應用于發酵實驗，限制了菌株的應用。傳統經典分離方法補充了高通量測序技術的弊端，可為生產應用提供大量潛力菌種。此外，在實際生產中，酵母會受到脅迫條件的影響，如高溫、高糖、高乙醇環境等，因此生產中對菌株的生理特性有一定的要求，獲得菌株并開展對生存環境的耐受性是進行工業應用的基礎[15]。

清香型白酒釀造體系復雜，對微生物的變化演替研究成為熱點。王薇等[16]從清香型白酒酒曲酒醅中鑒定出10種酵母，除了常見的釀酒酵母、東方伊薩酵母、異常畢赤酵母、扣囊腹膜孢酵母外，阿氏絲孢酵母(Trichosporonasahii)、葡萄牙棒孢酵母(Clavisporalusitaniae)、高滲漢森菌(Hanseniasporaosmophila)、膜醭畢赤酵母(Pichiamembranifaciens)、粉狀畢赤酵母(Pichiafarinosa)和發酵畢赤酵母(Pichiafermentans)均為首次從清香型白酒釀造過程中分離獲得的酵母種類。杜艾明等[5]對黃鶴樓清香型白酒釀造體系中酵母進行了研究，主要為釀酒酵母、異常威克漢姆酵母、東方伊薩酵母、扣囊腹膜孢酵母和扁平云假絲酵母，其中釀酒酵母和異常威克漢姆酵母為優勢菌。耿添霈等[17]從汾酒缸花中篩選出畢赤酵母(Pichia)、威克漢姆酵母(Wickerhamomyces)、腹膜孢酵母(Saccharomycopsis)、假絲酵母(Candida)與邁耶氏酵母(Meyerozyma)5個酵母屬，其中馬朗加腹膜孢酵母(Saccharomycopsismalanga)首次在清香型白酒釀造環境中發現。我們前期對勁牌公司小曲白酒酒曲和酒醅中酵母進行篩選，獲得幾株釀酒酵母和畢赤酵母，種類較少[18]，可能是環境中霉菌生長過快影響了酵母的純化和分離。而近期文獻報道，在培養基中添加有機酸可以很好地抑制霉菌生長，有利于酵母的生長[19]。因此，本文以多種常規培養基為基礎培養基，通過添加不同比例乳酸和乙酸抑制樣品中霉菌菌絲蔓延，從清香型小曲白酒酒曲和酒醅中分離酵母，并結合形態學和26S rRNA分子生物學技術鑒定其種屬。同時，對所篩選的酵母的生理特性和環境耐受性進行研究，以期為清香型小曲白酒生產儲備優良酵母資源。

1 材料與方法

1.1 儀器與設備

E200生物顯微鏡，尼康；2720 Thermal Cycler PCR儀，賽默飛世爾科技；DYY-8C電泳儀，北京六一生物科技有限公司；ZF-288全自動凝膠成像分析系統，上海嘉鵬科技有限公司；5424 R離心機，Eppendorf公司；WFJ 2000可見分光光度計，尤尼柯(上海)儀器有限公司；JJ6000電子天平，常熟市雙杰測試儀器廠；MJ-250BSH-Ⅱ霉菌培養箱，上海新苗醫療器械制造有限公司；SW-CJ-1B凈化工作臺，蘇州智凈凈化設備有限公司；YXQ-LS-75SII高壓滅菌鍋，上海博迅實業有限公司醫療設備廠。

1.2 材料與試劑

1.2.1 實驗樣品和試劑

分離酵母所用酒醅樣品于2019年10～12月取自勁牌公司楓林三分廠釀造三車間，酒曲取自勁牌毛鋪制曲車間。

生化試劑：PDA培養基，海博生物技術有限公司；孟加拉紅瓊脂培養基、蛋白胨、瓊脂粉，國藥集團化學試劑有限公司；酵母浸粉，北京奧博星生物技術有限公司；青霉素，華北制藥股份有限公司；黃豆芽，超市購買；麥芽浸粉，天津市利發隆化工科技有限公司。

分析純試劑：葡萄糖、丙酸鈉、乳酸、乙酸、脫氧膽酸鈉、KH2PO4、K2HPO4、MgSO4、KNO3、Na2HPO4、NaH2PO4、KCl、FeSO4、蔗糖、乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-2Na)、甘油，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2.2 培養基及試劑配制

PDA培養基：按照PDA合成培養基配方稱取適量樣品，并加入10 g/L的丙酸鈉加熱溶解，傾倒平板前加入0.5 g/L的青霉素或3.3 mL/L的乙酸[19](下同)。

YPD培養基(g/L)：酵母浸粉10，葡萄糖20，蛋白胨20，瓊脂20，傾倒平板前加入0.5 g/L的青霉素。分別加入0.3 g/L脫氧膽酸鈉，或3.3 mL/L的乙酸，或V(乙酸)∶V(乳酸)=1∶1(乙酸3.0 mL/L)，或V(乙酸)∶V(乳酸)=1∶2(乙酸2.3 mL/L)，V(乙酸)∶V(乳酸)=1∶3(乙酸2.0 mL/L)。

孟加拉紅培養基(g/L)：蛋白胨5，葡萄糖10，KH2PO41，無水MgSO40.5，孟加拉紅0.033，瓊脂20。傾倒平板前加入0.5 g/L的青霉素。分別加入0.3 g/L脫氧膽酸鈉，或3.3 mL/L的乙酸。

察氏培養基(g/L)：蔗糖30，NaNO33，K2HPO41，MgSO40.5，KCl 0.5，FeSO40.01，瓊脂20。

豆芽汁葡萄糖培養基(g/L)：黃豆芽100，葡萄糖50，瓊脂20。稱取新鮮黃豆芽100 g，置于燒杯中，加入1 000 mL水，加熱至沸騰，維持30 min，用8層紗布趁熱過濾，濾渣棄去。濾液補充水分到1 000 mL，即制成10%豆芽汁，再加入葡萄糖煮沸，之后加入瓊脂，繼續加熱融化，再分裝，傾倒平板前加入0.5 g/L的青霉素。

麥芽汁瓊脂培養基(g/L)：麥芽浸粉30、瓊脂15。傾倒平板前加入0.5 g/L的青霉素和3.3 mL/L的乙酸。

DNA提取重懸液：50 mmol/L pH 7.4磷酸鈉緩沖溶液、1 mmol/L EDTA-2Na、體積分數5%甘油。

以上培養基和重懸液使用前均于121 ℃滅菌20 min。

1.3 實驗方法

1.3.1 酵母的分離純化方法

取5 g酒醅或酒曲樣品置于裝有95 mL無菌水的三角瓶中，置于150 r/min搖床中，30 min后取出，梯度稀釋，分別取200 μL濃度為10-3和10-4CFU/mL的菌懸液分別涂布于YPD培養基、孟加拉紅培養基、PDA培養基、豆芽汁葡萄糖培養基、麥芽汁瓊脂培養基和察氏培養基上，30 ℃倒置培養2～3 d，對平板上所得到的不同酵母菌落進行劃線純化，將得到的純化菌株接種到YPD培養基上，培養2～3 d后在4 ℃保藏。

1.3.2 酵母的形態描述

將分離純化的酵母接種到YPD培養基上，30 ℃培養2～3 d，在顯微鏡下觀察酵母細胞形態和出芽情況。

1.3.3 酵母DNA的提取與PCR擴增[20]

取1.5 mL離心管，加入100 μL雙蒸水，無菌條件下挑取酵母菌體于離心管中攪勻，將混合物充分渦旋，在8 000～10 000×g離心1 min。吸取上清液，加入100 μL重懸液，置于85 ℃下水浴40 min，然后置于-20 ℃下冷凍10 min，即得到DNA，以其為模板，采用真菌通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)及18S-P1(5′-CCAGGCTTTACACTTTATGC-3′)和18S-P2(5′-GCGATTAAGTTGGGTAACGC-3′)。PCR反應體系為PremixTaq15 μL、DNA菌液2 μL、引物①0.5 μL、引物②0.5 μL，最后用雙蒸水補充至30 μL。PCR反應程序為94 ℃預變性5 min，接下來35個循環包括94 ℃變性30 s，52 ℃退火50 s，72 ℃延伸1 min，最后一個循環在72 ℃延伸10 min。取5 μL PCR產物通過瓊脂糖凝膠電泳檢測條帶有無，最后將含有目的條帶的PCR原液送到武漢華大基因進行測序。將測序結果通過BioEdit軟件進行剪切，并輸入NCBI(美國國家生物技術信息中心)GenBank數據庫進行同源性檢索，獲得近似序列。

1.3.4 菌種生理生化鑒定

對篩選酵母進行糖發酵實驗、氮源同化實驗、碳源同化實驗、類淀粉實驗、脲酶實驗，參照文獻[21]。

1.3.5 菌株耐受特性分析[22-23]

將活化后的菌株按2%(體積分數)的接種量(107CFU/mL)接種于YPD液體培養基中，30 ℃培養2 d，用紫外分光光度計在600 nm處測定發酵液OD值?？疾鞂ο鬄槠咸烟琴|量濃度(0、50、100、150、200、250 g/L)、乙醇體積分數(3%、6%、9%、12%、15%)、pH(2.5、3.0、3.5、4.0、4.5)和溫度(15、25、30、45、55 ℃)。

1.3.6 數據處理

使用Origin 2016對實驗數據進行統計分析，Photoshop CS5對圖片進行處理。

2 結果與分析

2.1 酵母的分子生物學鑒定

從酒曲酒醅中共分離出71株酵母，因7株菌在表觀形態、微觀形態相似，故共鑒定了64株，其中1株酵母(J-13)沒有鑒定出。如表1所示，鑒定出的63株酵母分屬于7個屬13個不同種，分別為異常威克漢遜酵母(12株)、扣囊腹膜孢酵母(4株)、季也蒙畢赤酵母(1株)、庫德里阿茲威畢赤酵母(17株)、發酵畢赤酵母(10株)、外島畢赤酵母(1株)、膜醭畢赤酵母(1株)、釀酒酵母(10株)、白地霉(2株)(A.loubieri(1株)、T.loubieri(2株)、阿氏絲孢酵母(1株)和S.pararoseus(1株))，其中A.loubieri、T.loubieri和S.pararoseus首次在清香型白酒中發現。

2.2 分離純化的酵母在平板上的菌落形態特征

如圖1所示，釀酒酵母呈乳白色圓形，有光澤，邊緣整齊，顯微下為圓球形。季也蒙畢赤酵母呈白色奶油狀，平滑濕潤有光澤，顯微下為圓球形；發酵畢赤酵母呈乳白色無光澤，邊緣不整齊，菌落凸起，有褶皺，單個酵母細胞為橢圓形；庫德里阿茲威畢赤酵母菌落形態為奶油白色圓形，邊緣呈齒蝕狀，菌體凸起有褶皺，顯微下為橢圓形；膜璞畢赤酵母為乳白色，邊緣不整齊，菌落凸起有褶皺，單個酵母細胞呈梭形和卵圓形；外島畢赤酵母為乳白色，邊緣不整齊有短小絨毛，菌落凸起有褶皺，單個酵母細胞為卵圓形。這幾類酵母在白酒風味物質形成中具有重要的作用[24]。異常威克漢遜酵母菌落呈奶油白色圓形，邊緣環紋起皺，菌體黏稠，顯微下為卵圓形和橢圓形；扣囊腹膜孢酵母菌落形態為白色圓形，質地呈短絨毛狀，菌落邊緣呈齒蝕狀，顯微下為卵圓形，有假菌絲和子囊孢子；白地霉呈奶白色圓形，表面絨毛狀，生長直徑可達2 cm左右，顯微下能觀察到橫隔和節孢子，孢子形狀為長筒形，末端鈍圓。阿氏絲孢酵母、A.loubieri和T.loubieri均為絲孢酵母屬下不同種。阿氏絲孢酵母為白色圓形，無光澤有凸起，呈腦回狀，菌落邊緣呈齒蝕狀，顯微下為圓形，長桿形、末端鈍圓，有假絲和厚垣孢子；A.loubieri為淡黃色，菌落隆起無光澤，邊緣整齊，單個細胞為球形或短矩圓形，有假菌絲。T.loubieri菌落早期為乳白色，菌體濕潤，邊緣不整齊，中間凸起，后期菌落漸漸變黃，菌體干燥，可見伸入培養基假菌絲，單個酵母細胞為圓球形，有假菌絲，并可見橢圓形和柱狀的關節孢子。近玫色鎖擲孢酵母呈橘紅色圓形，光滑濕潤，邊緣整齊，顯微形態為圓形和橢圓形。

2.3 酵母菌株生理生化實驗

如表2所示，糖發酵結果表明大多數酵母均可發酵葡萄糖、蔗糖，或對葡萄糖、蔗糖有可變反應；能發酵麥芽糖的酵母占一半，僅扣囊腹膜孢酵母(J-6)發酵可溶性淀粉，T.loubieri(J-39)發酵乳糖和海藻糖；阿氏絲孢酵母(J-5)和膜璞畢赤酵母(J-26)均不發酵這6種糖類。氮源同化實驗結果表明A.loubieri、T.loubieri、白地霉、膜璞畢赤酵母、扣囊腹膜孢酵母和發酵畢赤酵母對硝酸鈉具有同化作用，其余酵母對硝酸鹽不具有同化作用。脲酶實驗結果表明發酵畢赤酵母和近玫色鎖擲孢酵母為脲酶產生菌株，其余菌株為不產生脲酶菌株。類淀粉合成實驗結果表明這13種酵母菌均不合成類淀粉。

A-酵母菌落；B-顯微形態；A1-P.exigua菌落； A2-P.membranifaciens菌落圖1 13種不同酵母菌落和顯微形態Fig.1 Colonies and microscopic morphology of 13 different yeasts

表2 不同酵母生理生化實驗結果Table 2 Results of physiological and biochemical experiments of different yeasts

2.4 環境耐受性分析

2.4.1 耐高糖實驗

如圖2所示，釀酒酵母(J-52)、扣囊腹膜孢酵母(J-6)和T.loubieri(J-39)生物量隨著糖濃度升高而增加，在最高糖質量濃度250 g/L下均可生長，說明此3株酵母葡萄糖耐受性最高；白地霉(J-23)和A.loubieri(J-14)菌株僅在葡萄糖含量低時生物量最高，說明其葡萄糖耐受性較差。

圖2 葡萄糖含量對酵母生長的影響Fig.2 Effect of glucose content on yeast growth

2.4.2 耐乙醇實驗

如圖3所示，所有酵母菌株隨著乙醇含量增加生長均受到抑制，酵母生物量減少，相對來說，釀酒酵母(J-52)耐乙醇能力最強，在12%乙醇(體積分數，下同)下仍有一定的生長，扣囊腹膜孢酵母(J-6)和庫德里阿茲威畢赤酵母(J-8)耐乙醇能力其次，在9%乙醇下仍生長較好。白地霉(J-23)和膜璞畢赤酵母(J-26)耐乙醇性最差，即使在最低乙醇3%時生長仍受到抑制。

圖3 乙醇含量對酵母生長的影響Fig.3 Effect of alcohol content on yeast growth

2.4.3 耐pH實驗

如圖4所示，所有酵母菌株生物量隨著pH增加而減少，釀酒酵母(J-52)、扣囊腹膜孢酵母(J-6)和庫德里阿茲威畢赤酵母(J-8)生物量較高，耐酸性較強；膜璞畢赤酵母(J-26)生物量最低，耐酸性最差。

2.4.4 耐高溫實驗

如圖5所示，所有酵母生物量隨溫度升高呈現先上升后下降趨勢，其中T.loubieri和異常威克漢遜酵母在45 ℃具有最高生物量，說明這2株菌在45 ℃高溫下能較好生長；與其它酵母菌株相比，庫德里阿茲威畢赤酵母和釀酒酵母在55 ℃下仍具有較高生物量，表明它們耐高溫性好。

圖5 培養溫度對酵母生長的影響Fig.5 Effect of temperature on yeast growth

3 結論

本研究通過經典分離法從勁牌公司酒曲和酒醅中獲得了71株酵母，結合分子生物學技術鑒定了63株，分屬于7個屬13個種，從種類可以看出，多為釀酒酵母、異常威克漢遜酵母、庫德里阿茲威畢赤酵母和發酵畢赤酵母。其中篩選得到的A.loubieri、T.loubieri和S.pararoseus是實驗室菌種庫前期未篩選到的，在清香型白酒中未見報道，通過資料查詢發現此3種菌均存在于其他香型白酒酒曲中，對白酒風味形成具有貢獻作用。有研究表明，T.loubieri為條件致病菌，但目前未見其在白酒釀造中致病的報道，未來有必要加大該菌在釀造中的生長代謝研究，明確其生物安全性。另外，經過生理特性研究，大多數酵母能發酵葡萄糖和蔗糖，A.loubieri、T.loubieri、白地霉、膜璞畢赤酵母、扣囊腹膜孢酵母和發酵畢赤酵母對NaNO3具有同化作用，發酵畢赤酵母和S.pararoseus為脲酶產生菌株，13種酵母均不能合成類淀粉?？鼓嫘匝芯勘砻?，釀酒酵母(J-52)、扣囊腹膜孢酵母(J-6)、庫德里阿茲威畢赤酵母(J-8)和T.loubieri(J-39)對高糖、高乙醇、高酸和高溫具有良好的耐受性，具有廣泛的應用前景。下一步將在清香型小曲白酒釀造工藝下對這13種酵母代謝產物及與其他菌株互作關系開展研究，探討其對原酒質量影響，以期為清香型小曲白酒品質提升，提供優勢菌株。