分光光度法測定奶酪中亞硝酸鹽含量的不確定度評定

鄔 婧

（北京市朝陽區食品藥品安全監控中心，北京 100124）

很多食物中都含有亞硝酸鹽，亞硝酸鹽對人的身體有一定的危害，新聞中報道的由亞硝酸鹽引發食物中毒的事件不在少數[1-2]。我國對亞硝酸鹽的使用和安全管理有著嚴格要求，按照標準規定使用亞硝酸鹽是安全的。國家標準規定亞硝酸鈉、亞硝酸鉀可作為護色劑、防腐劑在腌臘肉制品、醬鹵肉制品和熏、燒、烤肉等加工中使用，并規定了最大使用量和最大殘留量。以下對奶酪亞硝酸鹽不確定度測定工作中分光光度法的應用及不確定性來源進行探討。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

市售奶酪，隨機購買。3%乙酸溶液、4 g/L對氨基苯磺酸溶液；2 g/L鹽酸萘乙二胺溶液；200 μg/mL亞硝酸鈉標準溶液[北京海岸鴻蒙標準物質技術有限責任公司，標準物質編號GBW(E)100156]。

1.2 儀器與設備

UV-2600紫外可見分光光度計（日本島津公司）；ME203分析天平[梅特勒-托利多（上海）有限公司]；并根據要求對儀器進行校準。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品處理

依據《食品安全國家標準 食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》（GB 5009.33—2016）中的第二法分光光度法進行測定。將樣品研磨成均勻的泥漿狀，混合均勻。稱取試樣2.5 g（精確至0.001 g），將選取好的樣品置于150 mL具塞錐形瓶中。加水80 mL后搖勻，超聲30 min后取出放置至室溫。定量轉移至100 mL容量瓶中，加入3%乙酸溶液2 mL，加水稀釋至刻度，混合均勻。于4 ℃放置20 min，取出放置至室溫，溶液經過濾紙過濾，濾液備用。

1.3.2 亞硝酸鹽含量的測定

吸取40 mL濾液于50 mL帶塞比色管中，另吸取亞硝酸鈉標準使用液（5.0 μg/mL）0 mL、0.20 mL、0.40 mL、0.60 mL、0.80 mL、1.00 mL、1.50 mL、2.00 mL和2.50 mL。然后對樣品進行處理，在試管中加入2 mL的4 g/L對氨基苯磺酸溶液，混勻，靜置3～5 min后加入1 mL的2 g/L鹽酸萘乙二胺溶液，加水至刻度線，混勻后靜置15 min。用1 cm比色杯，以零管調節零點，于波長538 nm處測定，繪制標準曲線，同時做空白對照[4]。

1.3.3 數學模型

式中：x為樣品中亞硝酸鹽含量，mg/kg；V1為樣本溶液的總體積，mL；V2為樣本測試液(原液)的體積，mL；m1為試樣質量，g；m2為測定用樣液中亞硝酸鈉的質量，μg。

1.3.4 不確定度來源分析

不確定度來源包括測定樣品中亞硝酸鹽平均值引入的相對標準不確定度[3]、稱量引入的相對標準不確定度、試樣液總體積引入的相對標準不確定度、測定用樣液體積引入的相對標準不確定度、亞硝酸鈉標準溶液濃度引入的相對標準不確定度、紫外可見分光光度計引入的相對標準不確定度、測定用樣液中亞硝酸鈉的質量引入的相對標準不確定度。

2 不確定度的評定

2.1 測定樣品中亞硝酸鹽平均值引入的相對標準不確定度

本實驗對奶酪中亞硝酸鹽含量進行6次測定，測量值分別為1.298 mg/kg、1.323 mg/kg、1.302 mg/kg、1.319 mg/kg、1.322 mg/kg及1.302 mg/kg，平均值為1.311 mg/kg，計算標準偏差為0.011 5，則測定平均值引入的標準不確定度為：

平均值的相對標準不確定度為：

2.2 稱量產生的相對標準不確定度

稱量樣品的平均質量為2.502 g，根據天平的檢定證書可知，稱量質量在0～50 g時，U=1.0 mg，k=2，則稱量產生引入的標準不確定度為：

稱量產生的相對標準不確定度為：

2.3 試樣液總體積引入的相對標準不確定度

（1）對樣品的定容引入不確定度進行計算，根據100 mL容量瓶的檢定證書可以得出，容量瓶在進行擴展的時候擴展的不確定度是U=0.020 mL，k=2。得出樣品的定容引入的標準不確定度為：

（2）溫度引入的不確定度。將實驗的溫度控制在20 ℃，在（20±5）℃的環境進行條件反應的時候，水的體積的膨脹系數為2.1×10-4/℃。則由溫度引入的不確定計算為：

（3）合成上述兩項不確定度分量，試樣液總體積的標準不確定度為：

試樣液總體積引入的相對標準不確定度為：

2.4 測定用樣液體積引入的相對標準不確定度

（1）移液過程引入的不確定度，選擇樣品液的劑量為40 mL，用5 mL的移液器，分8次進行提取。在選擇容器的時候，容器的擴展度U=0.1%，k=2，則吸取樣液體積引入的標準不確定度計算為：

（2）溫度引入的不確定度。將實驗的溫度控制在20 ℃，在（20±5）℃的環境進行條件反應的時候，應該仔細觀察水的體積的膨脹情況，此時水的體積的膨脹系數為2.1×10-4/℃。則由溫度引入的不確定計算為：

（3）合成上述兩項不確定度分量，測定用樣液體積的標準不確定度為：

測定用樣液體積引入的相對標準不確定度為：

2.5 亞硝酸鈉標準溶液濃度引入的相對標準不確定度

2.5.1 亞硝酸鈉標準溶液引入的不確定度

亞硝酸鈉標準溶液濃度為200 μg/mL，標準溶液證書提供的不確定度U=2%，k=2，標準溶液的不確定度為：

亞硝酸鈉標準溶液的相對標準不確定度為：

2.5.2 移液體積引入的不確定度

（1）用5 mL的移液器。在選擇容器的時候，容器的擴展度U=0.1%，k=2，則吸取樣液體積引入的標準不確定度計算為：

（2）溫度引入的不確定度。將實驗的溫度控制在20 ℃，在（20±5）℃的環境進行條件反應的時候，應該仔細觀察水的體積的膨脹情況，此時水的體積的膨脹系數為2.1×10-4/℃。則由溫度引入的不確定計算為：

合成上述兩項不確定度分量，移液體積的標準不確定度為：

移液體積引入的相對標準不確定度：

2.5.3 定容體積引入的不確定度

（1）100 mL容量瓶引入的不確定度。從100 mL容量瓶的檢定證書中可以得出，容量瓶在進行擴展的時候擴展的不確定度是U=0.020 mL，k=2。這一過程中樣品的定容是100 mL，引入的標準不確定度計算為：

（2）溫度引入的不確定度。將實驗的溫度控制在20 ℃，在（20±5）℃的環境進行條件反應的時候，此時水的體積的膨脹系數為2.1×10-4/℃。則由溫度引入的不確定計算為：

合成上述兩項不確定度分量，定容體積的標準不確定度為：

定容體積引入的相對標準不確定度：

合成上述3項相對不確定度分量，亞硝酸鈉標準溶液濃度引入的相對標準不確定度為：

2.6 紫外可見分光光度計引入的相對標準不確定度

紫外可見分光光度計所產生的標準不確定度，在對這些度數進行計算的時候，也應該利用特定的公式和特定的算法用波長進行檢測，于波長538 nm處測定，然后還應該對波長進行擴展，仔細觀察波長測量的數據，對于波長的不確定性進行記錄。然后應該仔細觀察波長測量的數據和紫外線可見光度的數據，利用特定的公式對紫外線可見光的光度進行計算，進而得出紫外線的不確定度。根據UV-2600紫外分光光度計的檢定證書為U=0.3 nm，k=2，計算儀器的不確定度為：

儀器的相對標準不確定度為：

2.7 亞硝酸鈉標準曲線引入的相對標準不確定度

實驗過程中對標準曲線進行擬定，對擬定標準曲線引入的不確定度進行計算。配制9個濃度分別為0 μg/mL、1.0 μg/mL、2.0 μg/mL、3.0 μg/mL、4.0 μg/mL、5.0 μg/mL、7.5 μg/mL、10.0 μg/mL和12.5 μg/mL的亞硝酸鈉標準溶液，用分光光度法測量得到相應的吸光值，得到直線方程Y=bx+a和其相關系數r，如表1所示。

表1 亞硝酸鹽標準曲線結果表

本實驗得到的亞硝酸鹽標準曲線方程為Y=0.072 508 8x-0.015 731 0，相關系數r2=0.999 61。根據擬合工作曲線有關的不確定度公式計算為[1]：

本次實驗測定的樣品濃度為1.311 mg/kg，則擬合標準曲線引入的相對標準不確定度為：

3 合成標準不確定度

針對以上分析的各個不確定度分量，合成相對標準不確定度為：

取包含因子k=2，則測量結果的擴展不確定度為0.032 mg/kg[5]。該奶酪中亞硝酸鹽的結果是1.311 mg/kg，因此結果可表示為（1.311±0.032）mg/kg。

4 結論

總之，在對奶酪中的亞硝酸鹽含量進行實驗計算和提取的時候應該利用相關的公式進行數據計算，如果包含因子是2，通過公式計算出最終奶酪中亞硝酸鹽含量的擴展不確定度為0.032 μg/mL。實驗人員在進行實驗操作的時候，應該嚴格按照標準進行實驗操作，同時對各類數據進行詳細的歸類和整理。應該切實做好實驗操作，嚴格按照步驟進行實驗。