大豆多肽發酵液脫色及不同超濾組分抗氧化研究

李樂樂，楊學為，羅雪韻，范 柳，尹樂斌,2*

（1.邵陽學院 食品與化學工程學院，湖南邵陽 422000；2.豆制品加工與安全控制湖南省重點實驗室，湖南邵陽 422000）

豆渣是豆制品加工副產物，其富含膳食纖維、有機酸和蛋白質等營養成分。由于豆渣有機物豐富，水分大且口感粗糙，導致其處理成本高昂，豆渣的綜合利用也成為豆制品企業急需解決的問題[1]。大豆多肽即肽基蛋白水解物，其主要是通過酶解和微生物發酵使大分子蛋白水解為小分子多肽，研究表明大豆多肽具有抗氧化、降血壓、降血糖和抗疲勞等生理活性[2-4]。不同分子量大豆多肽生理活性也存在差異。鄧成萍等[5]運用中性蛋白酶和堿性蛋白酶雙酶水解制備大豆多肽，并超濾分離成4個多肽組分，同時探究不同分子量多肽的物理性質和生物活性，研究發現小分子大豆多肽的DPPH自由基清除能力和ACE抑制活性顯著增強。

超濾分離是一種應用廣泛的膜分離技術，在壓力差作用下利用超濾膜將不同分子量物質分離，具備操作簡單、成本低、適應力強等優勢，通常被用于分離純化多肽、多糖等活性成分[6]。豆渣經枯草芽孢桿菌發酵制備大豆多肽，其發酵液顏色較深。本實驗利用活性炭對發酵液進行脫色處理，超濾分離純化不同組分多肽，并對其抗氧化活性進行比較分析，以深入了解不同組分多肽的生理活性，同時為探究大豆多肽的純化技術提供有效的指導。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與菌株

豆渣由實驗室提供；枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），綠隴生物有限公司。

1.1.2 試劑

活性炭，臺山市粵僑試劑塑料有限公司；ABTS，分析純，安徽酷兒生物工程有限公司；DPPH，分析純，南京都萊生物技術有限公司；抗壞血酸，福晨化學試劑有限公司。

1.1.3 儀器與設備

SCIENTZ-10N冷凍干燥機，寧波新芝生物科技股份有限公司；VELOCITY 14R臺式冷凍離心機，Dynamica公司；D-7型紫外分光光度計，南京菲勒儀器有限公司；微濾機組，使用纖維膜和不同分子量的超濾膜，上海摩速科學器材有限公司。

1.2 方法

1.2.1 大豆多肽的制備

回收干凈的濕豆渣利用精細磨粉碎成糊漿狀，加入純化水調整豆渣的干基使其達到5.8%，在豆渣糊中加入纖維素酶水解形成豆渣酶解液，將其置于80 ℃水浴鍋滅酶10 min（將pH值調整為7.2）。將枯草芽孢桿菌接種在豆渣酶解液中開始液態發酵（控制發酵條件為溫度37 ℃，接種量3%，時間60 h），將發酵液在冷凍離心機下以10 000 r/min離心10 min后取上清液保存備用。

1.2.2 活性炭脫色處理

由于豆渣發酵液顏色呈黃褐色，因此考慮利用活性炭進行脫色處理。量取20 mL發酵液置于錐形瓶中，在一定的活性炭用量（0.25%、0.50%、1.00%、1.50%和2.00%）、脫色溫度（30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃和70 ℃）、脫色 時 間（15 min、30 min、45 min、60 min和75 min）下對豆渣發酵液進行脫色處理，脫色液經抽濾和離心后，在400 nm波長下測定脫色前后吸光度變化，在540 nm波長下測定脫色前后多肽含量變化，以脫色率和多肽保留率為指標，確定最佳脫色條件。脫色率和多肽保留率計算公式如下：

式中：A1為脫色前吸光度；A2為脫色后吸光度；B為脫色后多肽含量，%；B0為脫色前多肽含量，%。

1.2.3 超濾分離

將脫色處理后的發酵液進行冷凍離心（5 200 r/min，12 min），分別通過預先清洗的纖維膜和10 kDa、5 kDa、3 kDa和500 Da的超濾膜，壓力調整為40 MPa，25 ℃下進行回流超濾。發酵液最初體積為4 000 mL，起初將發酵液通過含有纖維膜的柱子以除去其中的不溶性雜質，然后由大到小經過10 kDa、5 kDa、 3 kDa、500 Da超濾膜，分階段收集5～10 kDa、3～5 kDa、500～3 000 Da和＜500 Da的組分，將不同組分樣品進行冷凍干燥，凍干粉置于-20 ℃保存備用。

本課題的前期實踐研究階段已告一段落，在前期實踐研究中各教研組扎實的開展課例研討活動、學校舉辦了青年教師賽課活動，本課題小組通過這一系列的活動收集到與課題相關的課例小結、課堂實錄、教學反思以及經驗論文等資料，已取得部分的成效，現將研究情況報告如下。

1.2.4 多肽的抗氧化性

測定不同多肽組分的ABTS陽離子清除率、DPPH自由基清除率、OH自由基清除率[7-8]。根據不同自由基在不同波長下存在特征吸收峰確定波長，由于自由基與抗氧化劑共存時，其體系溶液顏色變淺，故可以用于判定多肽樣品的抗氧化能力，根據不同波長下樣品的吸光度值即可得到不同自由基的清除率。

2 結果與分析

2.1 活性炭脫色處理

2.1.1 脫色溫度對發酵液脫色效果的影響

如圖1所示，隨著脫色溫度提高，發酵液脫色率呈先快速上升后趨于緩慢下降的趨勢，多肽保留率呈先急劇下降后緩慢下降得趨勢，當脫色溫度低于50 ℃時，隨著溫度升高，發酵液脫色率快速升高且多肽保留率下降明顯，當溫度超過50 ℃時，脫色率和多肽保留率緩慢降低，可能是由于溫度升高，體系中分子加快擴散，加速了活性炭對色素及其他分子的吸附，但當溫度過高，會使活性炭的解吸大于吸附，同時也會使部分活性成分損失[9]。綜合考慮，選擇脫色溫度50 ℃為最佳。

圖1 脫色溫度對發酵液脫色效果的影響

2.1.2 脫色時間對發酵液脫色效果的影響

如圖2所示，隨著脫色時間的延長，發酵液脫色率呈先快速上升后趨于平緩的趨勢，多肽保留率呈先急劇下降后趨于平穩的趨勢，當脫色時間＞45 min，發酵液脫色率和多肽保留率相對穩定，這是由于活性炭吸附存在吸附和解析的動態平衡，在脫色時間45 min時到達了平衡點。綜合考慮，選擇脫色時間45 min為最佳。

圖2 脫色時間對發酵液脫色效果的影響

2.1.3 活性炭添加量對發酵液脫色效果的影響

圖3 活性炭添加量對發酵液脫色效果的影響

2.2 抗氧化能力測定

2.2.1 ABTS陽離子清除率測定

ABTS與過硫酸鉀反應，生成藍綠色的ABTS自由基在734 nm處有特征吸收峰，當與抗氧化劑共存時，體系顏色變淺，在734 nm處的吸光度下降，因其反應靈敏、操作簡便而被廣泛應用于抗氧化活性指標的評定[10]。不同多肽組分對ABTS陽離子清除效果如圖4所示，發酵液的不同超濾組分樣品均具有一定的清除效果，＜500 Da的多肽樣品比其他組分對ABTS陽離子清除效果強。

圖4 不同多肽組分對ABTS陽離子 清除效果

2.2.2 DPPH自由基清除率測定

DPPH是一種穩定的自由基，由于其具有單電子，其醇溶液在517 nm具有明顯的吸收峰，當DPPH中單電子與其他抗氧化劑中的單電子配對時，517 nm處吸光度降低，因此常被用來分析體外抗氧化實驗[10]。不同多肽組分對DPPH自由基清除效果如圖5所示，發酵液的不同超濾組分樣品對DPPH自由基都具有一定的清除效果，其中5～10 kDa的多肽樣品比其他組分清除效果強。

圖5 不同多肽組分對DPPH的清除效果

2.2.3 OH自由基清除率測定

OH自由基是活性氧中對生物體毒害作用最強的一種自由基，與細胞衰老和損傷有關[11]。不同多肽組分對OH自由基清除效果如圖6所示，發酵液的不同超濾組分樣品對OH自由基都具有一定的清除效果，其中3～5 kDa的多肽樣品比其他組分清除效果強。

圖6 不同多肽組分對OH的清除效果

3 結論

本研究利用枯草芽孢桿菌發酵豆渣酶解液制備大豆多肽，利用活性炭脫色處理，再通過超濾分離不同組分多肽，并研究不同組分的抗氧化能力。結果表明，最佳脫色條件為活性炭添加量1%、脫色溫度50 ℃、脫色時間45 min；不同組分對3種自由基均有一定的清除活性，其中＜500 Da多肽組分對ABTS陽離子自由基清除活性最強，5～10 kDa多肽組分對DPPH自由基清除活性最強，3～5 kDa對OH自由基清除活性最強。本研究為探究大豆多肽生理活性和開發前景提供數據參考。