苔干和竹筍提取物及其復配物的抗菌活性研究

陳志軒，華 奕，陳學紅，文 浩，孫會剛

（徐州工程學院 食品與生物工程學院，江蘇徐州 221018）

植物中抑菌物質種類研究和應用是當代研究熱點之一，許多專家和學者對植物的抑菌效果進行了大量研究，發現具有有效抑菌活性的植物可達1 400種[1-2]。其中，具有一定抑菌作用效果的次級代謝產物已經達到了40多萬種，這些次級代謝產物大致可分為黃酮類、生物堿類、多炔族類、有機酸類、酚類、甙族、木脂素和香豆素等[3]。

苔干有很高的營養和保健價值。張雪香等[4]分析測定了苔干中含有大量糖類、酚類、生物堿及黃酮類物質。甄清等[5]對苔干抗菌作用進行了實驗研究，得出苔干85 ℃的醇提取液具有抑菌性質，結果分析苔干的醇提取液中含黃酮類物質。甄清等[6]利用苔干的丙酮、乙酸乙酯提取液進行抑菌實驗，發現苔干提取液對短帚霉菌、犬小孢子菌等各類菌種都可能具有一定的抑制效果，竹筍也具有良好的抑菌作用。高雪娟等[7]用竹筍殼提取物進行抑菌試驗，結果表明，提取物對于根霉、黑曲霉、釀酒酵母這3種天然真菌沒有明顯的抑制作用，但是對于大腸桿菌、蠟樣芽孢桿菌、枯草黃芽孢桿菌及金黃色葡萄球菌等菌種具有顯著的抑制效果。彭昕等[8]對雷竹筍總甾醇和總黃酮的抑菌活性進行了研究，發現雷竹筍有機溶劑提取物對黑曲霉、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌等都具有良好的抑制作用，其對細菌抑制效果大于真菌，對革蘭氏陽性菌抑制效果大于革蘭氏陰性菌，并且總黃酮的抑菌效果通常比總甾醇的抑菌效果要更好。本文對提取溫度、提取時間、乙醇濃度和復配比例等一系列參數進行單因素抑菌實驗，探究苔干和竹筍的乙醇提取液對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌及蠟樣芽孢桿菌的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 植物

苔干，購于安徽亳州；竹筍，購于四川樂山。

1.1.2 培養基

LB固體培養基：蒸餾水400 mL，瓊脂8 g，氯化鈉（NaCl）4 g，酵母提取物2 g，胰蛋白胨4 g，pH為7.4～7.6。肉湯瓊脂固體培養基：蒸餾水400 mL，瓊脂7.2 g，氯化鈉（NaCl）6 g，胰蛋白胨4 g，牛肉膏6 g。葡萄糖瓊脂培養基：蒸餾水400 mL，瓊脂8 g，氯化鈉（NaCl）2 g，胰蛋白胨6 g，葡萄糖8 g，牛肉膏0.2 g。

1.1.3 菌種

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），徐州工程學院；蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus），徐州工程學院；大腸桿菌（Escherichia coli），徐州工程學院；金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），徐州工程學院。

1.2 儀器與設備

FA2140N電子天平，上海精密科學儀器；YP402N電子天平，上海精密科學儀器；立式高壓蒸汽滅菌鍋，日本Tomy Digital Biology；循環水真空泵，上海啟前電子科技；旋轉蒸發器，上海亞榮生化儀器；SW-CJ-1FD型單人單面凈化工作臺，蘇州凈化設備；KQ5200DE型數控超聲波清洗機，昆山市超聲儀器；烘箱，上海群基實驗儀器技術；GS-700高速多功能粉碎機，永康市天祺盛世工貿；BCD-539WT電冰箱，青島海爾；BCD-212KA電冰箱，青島海爾；恒溫恒濕箱，上海新苗醫療機械。

1.3 實驗方法

1.3.1 提取液的制備

以乙醇為溶劑，用超聲波輔助提取法[9]提取。精確稱量總量10 g的苔干與竹筍粉末，分別按不同質量比（7∶3、5∶5、3∶7）混合置于燒瓶中，分別倒入100 mL 50%的乙醇溶液，攪拌。調整超聲波清洗機參數至55 ℃、60 min。室溫靜置、抽濾濃縮，旋蒸至10 mL，制成1 g/mL的原液備用。

1.3.2 抑菌實驗

將4種菌液分別稀釋至10-3與10-4兩個梯度待用。用移液槍分別吸取100 μL的10-3和10-4兩個梯度菌液于合適的培養基上，用涂布器將菌液涂布均勻并做好標記。采用打孔法[10]在培養基上打好孔，將提取出來的抗菌活性物質注射適量到孔內。蓋上蓋子，將平板置于36.8 ℃的恒溫恒濕箱中，培養17 h后用游標卡尺測定抑菌圈大小。

1.3.3 單因素實驗

在提取過程中影響苔干和竹筍提取抗菌活性物質的主要參數有4個：復配比例、提取時間、提取溫度以及乙醇濃度。本實驗對每項參數進行3個水平的單因素實驗，提取時間：30 min、60 min、90 min；提取溫度：45 ℃、55 ℃、65 ℃；乙醇濃度：30%、50%、70%，并 分別用7∶3、5∶5、3∶7這3個復配比例來對每個參數進行重新提取，再測量其抑菌圈大小。每種方法測定兩種（10-3和10-4）菌液濃度。

2 結果與分析

2.1 抑菌實驗

當乙醇濃度為50%、提取溫度為55 ℃、提取時間為60 min時，苔干與竹筍的提取液及其復配液對10-3與10-4兩濃度的4種菌均有不同程度抑制效果。實驗結果如圖1所示。

圖1 提取液抑菌效果

2.2 不同提取條件的抑菌效果

通過實驗發現4種指示菌的實驗結果一致，以大腸桿菌為例得出的最佳提取條件，如表1和表2所示（表中數據為3次重復實驗平均值）。綜合實驗結果，提取時間為60 min，乙醇濃度為50%時，提取溫度65 ℃效果最好，在上述最優提取條件下，7∶3這個復配比例效果最好。

表1 不同提取條件對大腸桿菌的抑菌效果

表2 最優條件下不同復配比例對大腸桿菌的抑菌效果

2.3 復配比例對不同微生物的抑菌效果

由表3可知，在最優提取條件下（提取時間60 min、提取溫度65 ℃、乙醇濃度50%），苔干占比越高，抑菌效果越好，即最佳復配比均為7∶3。

表3 復配比例對不同微生物的抑菌效果（單位：mm）

3 結論

本研究以金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌及蠟樣芽孢桿菌為指示菌，通過一系列單因素抑菌實驗得到，乙醇作為提取溶劑時，苔干蘆筍最佳提取條件為提取時間60 min、提取溫度65 ℃以及乙醇濃度50%。在此條件下又進一步以復配比為變量，發現苔干竹筍復配比為7∶3時對4種菌抑制效果最好。