利福昔明在人工胃/腸液和大鼠腸道菌群及組織樣品中的穩(wěn)定性初步分析

陶 琦 劉希望 秦 哲 白莉霞 李世宏 李劍勇 楊亞軍

(中國農業(yè)科學院 蘭州畜牧與獸藥研究所/農業(yè)農村部獸用藥物創(chuàng)制重點實驗室/ 甘肅省新獸藥工程重點實驗室，蘭州 730050)

利福昔明是利福霉素衍生物(圖1)，其抗菌譜廣，抗菌活性強，局部給藥不易吸收，是高效低毒的抗生素。該藥物對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、需氧菌和厭氧菌等均有良好的抗菌活性；利福昔明(Rifaximin)是由意大利Alfa Wassermann S.P.A公司研制生產，1987年作為抗感染性腹瀉藥物在意大利上市，之后在國外被廣泛研究與應用；2004年通過SFDA批準，在我國廣泛應用于醫(yī)學臨床；近年來亦被用于獸醫(yī)臨床。利福昔明在醫(yī)學臨床中常被用于胃腸疾病的治療，如炎癥性腸病(Inflammatory bowel disease, IBD)、腸易激綜合征(Irritable bowel syndrome, IBS)等。在獸醫(yī)臨床中，利福昔明以灌注劑的形式用于動物疾病的治療。子宮和乳房灌注給藥后，可在子宮和乳房內保持較高的藥物濃度，以殺滅其中的敏感病原菌，用于相關疾病的治療，如奶牛子宮內膜炎和乳房炎等。

圖1 利福昔明結構式Fig.1 Structure of rifaximin

口服給藥是最為便捷的給藥途徑之一，而目前尚無口服的利福昔明制劑被批準用于獸醫(yī)臨床?？诜幬镞M入體內會受到胃腸不同酸堿環(huán)境、消化酶、腸道菌群，以及腸壁、肝臟代謝酶的作用，從而影響其藥效的發(fā)揮。國內獸醫(yī)臨床上，利福昔明以子宮和乳房灌注給藥為主。本研究采用高效液相色譜法(High performance liquid chromatography, HPLC)，考察了利福昔明在人工胃/腸液中的穩(wěn)定性以及大鼠腸道菌群、腸道及肝勻漿等對其的降解作用，為獸用相關口服制劑的設計與開發(fā)提供數據支持。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

利福昔明對照品(中國食品藥品檢定研究院，純度98.8%，批次：130496-201403),烏拉坦(NJKOCED，批號：C0028),胰蛋白酶(豬源，酶活 250 NFU/mg，索萊寶生物科技有限公司，批號：T8150),胃蛋白酶(豬源，酶活3 000-3 500 NFU/g，索萊寶生物科技有限公司，批號：P8390),磷酸鹽緩沖液(索萊寶生物科技有限公司，批號：D1040-500),厭氧培養(yǎng)基(CM1513，北京陸橋技術股份有限公司),乙腈(色譜純，Fisher)，鹽酸、磷酸二氫鉀、氫氧化鈉等均為國產分析純試劑。

1.2 主要儀器

超高效液相色譜儀-二極管陣列檢測器(安捷倫1290)，勻漿機(IKA-T25)，離心機(Multifuge X3R)，厭氧培養(yǎng)箱(Thermo)。

1.3 試驗動物

清潔級SD大鼠，6只，雄性，8～10周，體重210～230 g，購于中國農業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所，動物生產許可證號：NKMYD201907018。在試驗開始前，動物經過2周的隔離和適應。所有的試驗方案和程序，均獲得中國農業(yè)科學院蘭州畜牧與獸藥研究所動物倫理委員會的批準。

1.4 相關溶液配制

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標準儲備液與標準溶液

稱取利福昔明對照品適量，以乙腈溶解，配制成質量濃度為1 mg/mL的標準儲備液，于4 ℃存放備用。使用前以乙腈稀釋，得到實驗所需質量濃度的標準溶液。

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人工胃液的制備

按文獻方法[17]，取稀鹽酸16.4 mL，然后加水800 mL和胃蛋白酶10 g，充分溶解后，用3.65 g/L鹽酸溶液調節(jié)pH至1.3后，加水稀釋并定容至1 000 mL，即得人工胃液?？瞻兹斯の敢旱呐渲疲翰缓傅鞍酌?，其余與人工胃液配制方法相同。

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人工腸液的制備

按文獻方法[17]，取磷酸二氫鉀6.8 g，加水500 mL使其溶解，用4 g/L氫氧化鈉溶液調節(jié)pH至6.8；稱取胰蛋白酶10 g，加適量水使其充分溶解；將上述兩種溶液混合后，再以水稀釋并定容至1 000 mL，即得人工腸液?？瞻兹斯つc液的配制：除不含胰蛋白酶，其余與人工腸液配制相同。

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SD大鼠腸道菌群的制備,按參考文獻[18-19]，SD大鼠禁食12 h后，刺激腹部以采集新鮮糞便。將糞便與生理鹽水按比例(1 g∶5 mL)渦旋混合制成懸濁液，4 500 r/min離心10 min(4 ℃)，再將上清液與厭氧培養(yǎng)液按比例(

V

∶

V

=1∶9)混合，置厭氧培養(yǎng)箱中37 ℃過夜，制得腸道菌群培養(yǎng)液待用。

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空白組織樣品的制備

按參考文獻[20-22]，取SD大鼠(230～250 g) 6只，禁食不禁水過夜，腹腔注射烏拉坦麻醉后，迅速處死，采集肝臟、胃、小腸和大腸，用預冷的磷酸鹽緩沖液(4 ℃放置2 h)沖洗表面后剪碎，再將各組織與磷酸鹽緩沖液按質量與體積比例(1 g∶5 mL)混合，置于勻漿機中均質后，4 500 r/min離心10 min(4 ℃)，取上清液備用。離心前的操作均在冰浴條件下進行。

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厭氧培養(yǎng)基的制備

依培養(yǎng)基使用說明，稱取厭氧培養(yǎng)基9.5 g，加水800 mL搖勻，然后加水稀釋并定容至1 000 mL，混勻后分裝于試管中，于高壓濕熱條件下滅菌，制成厭氧液體培養(yǎng)基(GAM)，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 利福昔明的HPLC檢測方法

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色譜條件參考文獻[23]，略有調整。Phenomenex luna C18色譜柱(150 mm×4.6 mm, 5 μm)；流動相(A)為3.16 g/L甲酸銨，(B)為

V

∶

V

=1∶1，等度洗脫(

V

∶

V

=37∶63)；柱溫40 ℃；檢測波長276 nm；流速1.4 mL/min；進樣量20 μL；運行時間10 min。

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特異性分析

分別取空白人工胃液(1 mL)、空白人工腸液(1 mL)、人工胃液(1 mL)、人工腸液(1 mL)、人工胃液(1 mL)+利福昔明儲備溶液(10 μL)、空白人工腸液(1 mL)+利福昔明儲備液(10 μL)、空白人工胃液(1 mL)+利福昔明儲備液(10 μL)、空白腸道菌液(1 mL)、空白肝勻漿液(1 mL)、空白胃勻漿液(1 mL)、空白大腸及內容物的勻漿液(1 mL)、空白小腸及內容物的勻漿液(1 mL)。按照“1.7”項下的樣品前處理方法操作后，按“1.5.1”項下的色譜條件進樣分析，對比色譜圖。觀察在利福昔明標準溶液的出峰位置處，是否有其他物質干擾。

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重現性

配制質量濃度為10、40和100 μg/mL利福昔明標準溶液各6份，再按“1.5.1”項下進樣1次，記錄峰面積。

1.6 重復性

配制質量濃度為10、40和100 μg/mL利福昔明標準溶液各1份，于不同時間點(0、4、8、12和24 h)按照 “1.5.1”項下條件進樣分析，記錄峰面積。

1.7 利福昔明的穩(wěn)定性分析

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利福昔明在人工胃/腸液中的穩(wěn)定性測定

將上述制備好的空白人工胃液、空白人工腸液、人工胃液、人工腸液迅速分裝到EP管中(每管1 mL，每個時間點平行3份)，加入利福昔明儲備液(1 mg/mL)10 μL，混勻后于37 ℃水浴中孵育不同時間后分別取樣300 μL，加入冰乙腈(-20 ℃放置2 h)700 μL，渦旋混勻以終止反應，于4 ℃條件下12 000 r/min 離心10 min，取上清液過0.22 μm濾膜后，按“1.5.1”項下色譜條件進樣分析，記錄色譜峰面積。

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利福昔明在SD大鼠腸道菌群中的穩(wěn)定性測定

移取過夜培養(yǎng)液1 mL于EP管中，分別加入利福昔明標準儲備液10 μL，渦旋混勻后置入厭氧培養(yǎng)箱，培養(yǎng)不同時間后分別取樣0.5 mL于EP管中(每個時間點平行3份)，加入冰乙腈1 mL，渦旋混勻以終止反應，11 000 r/min離心10 min，取上清液過0.22 μm濾膜后，按“1.5.1”項下色譜條件進樣分析，記錄色譜峰面積。以培養(yǎng)相同時長不含利福昔明的培養(yǎng)液為空白對照，同法操作。

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利福昔明在空白組織樣品中的穩(wěn)定性測定

將上述制備好的上清液迅速分裝到EP管中(每管1 mL，每個時間點平行3份)，加入利福昔明標準儲備液10 μL，混勻后置37 ℃水浴中孵育不同時間后，移取300 μL，加入700 μL冰乙腈，充分渦旋以終止反應，12 000 r/min離心10 min，取上清液過0.22 μm濾膜后，按“1.5.1”項下色譜條件進樣分析，記錄色譜峰面積。

1.8 數據分析

采用GraphPad Prism 8軟件進行數據的統(tǒng)計分析，數據以Mean±SD表示。

P

<0.05表示差異顯著，

P

<0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 高效液相色譜法(HPLC)測定利福昔明的特異性分析

如圖2所示，在前述色譜條件下，利福昔明可被檢出，保留時間均為5.45 min，分離良好，不受背景干擾。表明在前述的樣品處理及色譜條件下，利福昔明的檢測不受基質干擾。

(a)空白人工胃液；(b)空白人工胃液+10 μg/mL利福昔明；(c)人工胃液；(d)人工胃液+利福昔明；(e)空白人工腸液；(f)空白人工腸液+10 μg/mL利福昔明；(g)人工腸液；(h)空白大鼠菌液；(i)空白大鼠大腸及內容物；(j)空白大鼠小腸及內容物；(k)空白大鼠胃液；(l)空白大鼠肝液。利福昔明保留時間為5.45 min。

2.2 高效液相色譜法(HPLC)測定利福昔明的重現性分析

如表1和2所示，利福昔明低、中、高3種質量濃度在不同時間點所得到的峰面積和保留時間。峰面積的RSD值為分別為0.27%、0.26%和0.25%；保留時間的RSD值分別為0.67%、0.33%和0.13%。結果表明方法重現性良好。

2.3 高效液相色譜法(HPLC)測定利福昔明的重復性分析

檢測相同濃度的平行樣品得到的峰面積如表3所示。RSD 值為分別為0.22%、0.16%和0.26%，表明方法的重復性良好。

2.4 利福昔明在人工胃/腸液中的穩(wěn)定性

以0 h時利福昔明的峰面積為100%，計算各時間點的剩余百分比，結果見圖3。如圖所示，經過37 ℃孵育6 h后，在空白胃液、人工胃液及空白腸液、人工腸液中的相對剩余百分率分別為(91.57±1.29)%、(84.03±0.49)%、(81.14±1.69)%和(78.12±1.20)%。盡管空白人工胃液4 h和6 h孵育后的剩余百分比分別比3和5 h的稍高，但沒有顯著性差別且基本處于穩(wěn)定狀態(tài)，主要原因可能是測定誤差造成的。結果說明，利福昔明在堿性或消化酶存在的條件下更易降解。

表1 HPLC測定利福昔明時儀器響應的穩(wěn)定性分析
Table 1 Stability analysis of instrument response for determination of rifaximin by HPLC

質量濃度/(μg/mL)Concentration峰面積/(mAU·min) Chromatographic peak area0 h4 h8 h12 h24 h平均值Average標準差SD相對標準差/%RSD10171.1171.5171.1170.7171.9171.30.460.2740610.6608.1606.6607.1607.4608.01.570.261001 452.61 443.21 145.51 444.71 446.81 446.63.620.25

表2 HPLC測定利福昔明時儀器保留時間的穩(wěn)定性分析
Table 2 Stability analysis of instrument retention time for determination of rifaximin by HPLC

質量濃度/(μg/mL)Concentration保留時間/min Retention time0 h4 h8 h12 h24 h平均值Average標準差SD相對標準差/%RSD105.3555.4495.4465.3845.4025.4070.0360.67405.4505.4595.4985.4505.4535.4620.0180.331005.4315.4285.4255.4295.4465.4320.0070.13

表3 HPLC測定利福昔明的重復性分析
Table 3 Repeatability analysis of rifaximin determination by HPLC

質量濃度/(μg/mL)Concentration峰面積/(mAU·min) Chromatographic peak area123456平均值Average標準差SD相對標準差/%RSD10171.1171.2170.6171.3171.6170.7171.10.380.2240608.7606.7608.1607.9608.2609.6608.10.950.161001 442.61 446.71 444.61 445.91 452.814 50.71 447.23.830.26

圖3 利福昔明在人工胃腸液中的孵育后的剩余利百分比Fig.3 The remaining percentage of rifaximin after incubation in artificial gastrointestinal fluid

2.5 利福昔明在SD大鼠腸道菌群中的穩(wěn)定性

以0 h時利福昔明的峰面積為100%，計算各時間點的剩余百分比，結果見圖4。經過37 ℃孵育12 h后，利福昔明在SD大鼠腸道菌群中孵育時發(fā)生了部分降解，但剩余百分比仍在90%上，總體表現出穩(wěn)定的趨勢。結果表明，利福昔明不易受SD大鼠腸道菌群的影響。

圖4 利福昔明在SD大鼠腸道菌群中的孵育后的剩余百分比(n=3)Fig.4 The remaining percentage of rifaximin in the intestinal flora of SD rats after incubation (n=3)

2.6 利福昔明在組織樣品中的穩(wěn)定性分析

以0 h時利福昔明的峰面積為100%，計算各時間點的剩余百分比，結果見圖5。如圖所示，經37 ℃ 孵育6 h后，利福昔明在胃液、肝液、大腸及其內容物、小腸及其內容物的相對剩余百分率分別為(92.09±0.63)%、(75.95±0.14)%、(83.90±0.91)%和(78.24±0.35)%。結果表明，利福昔明在空白SD大鼠胃勻漿液中基本穩(wěn)定，但在空白SD大鼠肝勻漿液、大腸及內容物勻漿液、小腸及內容物勻漿液中有一定的降解。

圖5 利福昔明在生物樣品中孵育后的剩余百分比(n=3)Fig.5 The remaining percentage of rifaximin after incubation in biological samples (n=3)

3 討 論

口服給藥是最為便捷的給藥方式，藥物在胃腸道的穩(wěn)定性，直接影響其藥效的發(fā)揮。因此，對藥物在胃腸道環(huán)境下的穩(wěn)定性進行考察，是新藥制劑研究開發(fā)的重要內容。

利福昔明是半合成的利福霉素類抗菌藥物，抗菌活性強，作用范圍廣，口服后不易吸收，可在腸道局部高濃度環(huán)境而發(fā)揮抗菌優(yōu)勢。在獸醫(yī)臨床中，利福昔明僅以注入劑的形式，被用作奶牛子宮內膜炎和乳房炎的治療。體外條件下考察胃腸液、腸道菌群、腸道及肝臟勻漿液對其穩(wěn)定性的影響，有助于利福昔明獸用口服制劑的研究與開發(fā)。

人工胃腸液模型包括人工胃液和人工腸液，腸道菌群可直接代謝藥物或作用于宿主系統(tǒng)，間接影響藥物代謝，動物組織樣品勻漿液更加接近體內環(huán)境；此三種體系易于制備，可在一定程度上反映體內情況，以此考察藥物的穩(wěn)定性，有助于了解藥物在胃腸道內的穩(wěn)定性情況，探討影響藥物穩(wěn)定性的因素，有助于指導藥物結構優(yōu)化和制劑的開發(fā)，在藥物研究與開發(fā)中已經被廣泛應用。

因此，本研究將利福昔明分別與人工胃腸液、SD大鼠(雄性)腸道菌群及不同組織樣品的勻漿液等共孵育，以考察pH、消化酶、腸道菌群和組織中的酶，對其穩(wěn)定性的影響。試驗結果說明：在體外模擬的胃腸道環(huán)境中，利福昔明是較穩(wěn)定的藥物，在酸性的空白人工胃液(不含酶)中總體呈現穩(wěn)定趨勢，而在堿性的人工腸液中有一定的降解，這可能與利福昔明的結構有關。肝臟是藥物代謝的主要器官，其中肝臟藥物代謝酶發(fā)揮主要的作用。利福昔明在SD大鼠肝勻漿液中有一定的降解，說明肝臟藥物代謝酶對利福昔明有一定的生物轉化作用；利福昔明在空白大鼠大腸及內容物勻漿液、小腸及內容物勻漿液中均有一定的降解，說明腸道對其穩(wěn)定性有一定的影響。Descombe等對利福昔明做了人體藥動學研究，結果顯示，志愿者口服給藥48 h后，一半以上血漿樣本未檢測出利福昔明，在給藥4 h后，僅有一半的血漿中能檢測出極少量的藥物(2～5.3 ng/mL)。在給藥后48 h，尿液樣本中檢測出微量的原形藥物；旅行者腹瀉患者每天口服利福昔明800 mg，連續(xù)口服3 d后，糞便中的原型藥物濃度非常高，平均為7 961 μg/g。研究結果表明，利福昔明在體內主要以原形發(fā)揮作用，并通過糞便以原形排出體外。說明利福昔明在胃腸道和肝臟內的降解較少。本研究結果亦表明，利福昔明在不同條件下僅發(fā)生了少量降解，與文獻報道基本一致。綜上，利福昔明在酸性環(huán)境中較穩(wěn)定，而在堿性條件下，胰蛋白酶、胃蛋白酶和腸壁、肝臟代謝酶等對其穩(wěn)定性的影響亦較為有限；因此，在開發(fā)獸用利福昔明口服制劑時，可減少對藥物本身穩(wěn)定性的考慮。后續(xù)將進行體外Caco-2細胞試驗，分析結腸上皮細胞對利福昔明的吸收轉運情況，為利福昔明開發(fā)獸用口服制劑提供數據支持。