青島萊西地區草莓根腐病菌鑒定及其拮抗木霉的篩選

王鈴朝 毛洪朔 劉燁貝 劉天彪 梁錦燕 佘明君 張茹琴

摘要 于2018—2019年從青島萊西地區10個草莓種植基地的30個采樣點共采集90份草莓根腐病病樣，利用組織分離法對病原菌進行了分離，結合形態學和分子生物學鑒定以及致病性測定，以確定引起該地區草莓根腐病的病原菌種類，同時初步測試了4株木霉對病原菌的抑菌效果及抑菌機理。結果表明，共分離到6種真菌，分別為膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）、尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）、新棒狀擬盤多毛孢（Neopestalotiopsis clavispora）、枝狀枝孢（Cladosporium cladosporioides）、菌核生枝頂孢（Acremonium sclerotigenum）和土曲霉（Aspergillus terreus）。前三者為草莓根腐病菌，膠孢炭疽菌和尖孢鐮刀菌的分離頻度分別為45.8%和32.1%，是優勢病原菌，新棒狀擬盤多毛孢分離頻度為8.4%。4株木霉通過競爭作用、產生非揮發性菌代謝產物抑制3種病原菌生長。培養3 d時，4株木霉代謝產物對3種病原菌的抑菌率為100%;培養7 d時下降，其中Ta1和Th2抑菌效果最好，前者對膠孢炭疽菌、尖孢鐮刀菌和新棒狀擬盤多毛孢的抑菌率分別為74.1%、62.5%和75.0%，后者分別為74.1%、73.8%和75.9%。二者對草莓根腐病具有一定生防潛力。

關鍵詞 草莓;根腐;分離;鑒定;木霉

中圖分類號 S 436.5? 文獻標識碼 A? 文章編號 0517-6611（2022）09-0143-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.09.036

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Identification of Pathogens Causing Root Rot on Strawberry in Qingdao Laixi and Screening of Their Antibiotic Trichoderma spp.

WANG Ling-chao， MAO Hong-shuo， LIU Ye-bei et al

（College of Plant Health & Medicine of Qingdao Agricultural University / Key Lab of Integrated Crop Disease and Pest Management of Shandong Province， Qingdao， Shandong 266109）

Abstract Ninety samples were collected from 30 plots in 10 strawberry planting bases in Qingdao Laixi from 2018 to 2019，and isolated by tissue isolating method， combined with morphology， molecular biological technology and pathogenic test， the species causing root rot of strawberries were identified， meanwhile， antibiotic effects and mechanisms of 4 Trichoderma spp. to the pathogens were studied. The results indicated that 6 fungal species were isolated from rotten tissues of strawberries， including Colletotrichum gloeosporioides， Fusarium oxysporum， Neopestalotiopsis clavispora， Cladosporium cladosporioides， Acremonium sclerotigenum and Aspergillus terreus. Among them， the first three was the pathogens causing root rot of strawberries， the document frequency （DF） of C. gloeosporioides and F. oxysporum was 45.8% and 32.1%， respectively， while that of N. clavispora was 8.4%. Four Trichoderma spp. inhibited the above pathogens by competition and production of non-volatile compounds. After three days of inoculation， the inhibition percentage of the 4 Trichoderma spp. to the three pathogens were 100%， however， seven days after inoculation， the inhibition percentage decreased， the inhibition percentage of trichoderma Ta1 and Th2 were the highest， those of Ta1 to C. gloeosporioides， F. oxysporum and N. clavispora were 74.1%， 62.5% and 75.0%， respectively;those of Th1 were 74.1%， 73.8% and 75.9%， respectively. Therefore， Ta1 and Th2 had the best antibiotic effects and biocontrol potentials against root rot of strawberries.

Key words Fragaria×ananassa;Root rot;Isolation;Identification;Trichoderma spp.

近年來，我國草莓產業迅速發展，但隨著栽培面積的擴大及多年連作，導致根腐病嚴重時發病率可達80%以上，給草莓生產帶來了巨大的經濟損失[1]。草莓根腐病癥狀表現為紅中柱根腐[2-3]、炭疽根腐[4-7]和黑根腐[8-9]，由土傳病原真菌甚至線蟲單獨或復合侵染根部所致。世界范圍內已報道的草莓根腐病菌達20多種[8]，主要有草莓疫霉（Phytophthora fragariae）[2-3]、炭疽菌（Colletotrichum spp.）[4-7]、絲核菌（Rhizoctonia spp.）[10-11]、鐮孢菌（Fusarium spp.）[12-13]、新棒狀擬盤多毛孢（Neopestalotiopsis clavispora）[5，14-15]、菜豆殼球孢（Macrophomina phaseolina）[16-17]、大雙孢土赤殼菌（Ilyonectria macrodidyma）[18]和Dactylonectria torresensis等[19-20]。

在農業生產中，由于化肥農藥的大量使用導致的環境污染、生態失衡、農產品品質下降及農殘超標等問題日益嚴重。木霉菌（Trichoderma spp.）是一類應用廣泛、防病效果顯著的生防菌[21]。較強的環境適應能力使其在與病原菌的競爭中占據優勢，主要通過競爭、重寄生、抗生作用、誘導抗性及協同拮抗作用，使得木霉對大部分病原菌表現出較高的拮抗活性[22]。木霉菌對草莓炭疽病[23-25]、灰霉病[23，26]、白粉病[27]、根腐病等[28-29]具有拮抗作用。盡管前人在木霉防治草莓病害方面做了大量的工作，但目前仍缺少可替代化學農藥防治草莓根腐病的高效木霉菌劑產品。

山東省青島地區是我國草莓主栽區之一，目前已報道的草莓根腐病病原物種類有棒形擬盤多毛孢菌（Pestalotiopsis clavispora）和膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）[5]。不同地區或同一地區，由于生態條件的差異，導致病原物優勢種類差異較大。為了確定青島萊西地區草莓根腐病菌的種類，筆者于2018—2019年共采集10個草莓種植地的90個病樣，在對病原物分離、鑒定及測定致病性的同時，初步測試了4株木霉對草莓根腐病菌的拮抗活性及機理，這對于明確草莓根腐病菌的種類、推廣木霉生物防治及減少化學農藥的使用具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 病樣采集

2018—2019年2—4月，選取萊西地區草莓（章姬品種）10個種植地采樣，每個種植地采集3個點，每個點取3株病樣，帶回實驗室立即分離。

1.2 培養基制作

分離用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA）和燕麥（OA）瓊脂培養基，純化及保存培養基用PDA培養基。

1.3 試驗方法

1.3.1 分離純化及保存。

先將病株根部沖洗干凈，瀝干水分。在超凈工作臺上，用75%乙醇表面消毒后，再用消毒手術刀剖開根部，從病組織中切取0.5 cm2大小的組織塊，轉接到PDA培養基或OA培養基上，每皿放置3塊，置于25 ℃黑暗培養。待組織塊邊緣長出菌絲體時，挑取菌絲體轉接到PDA培養基上純化，直至菌落生長一致沒有雜菌時，挑取菌絲體轉接至PDA斜面上，待長滿斜面后于4 ℃冰箱保存。

1.3.2 形態學鑒定。

觀察、記錄分離物的菌落顏色、生長速度等。制作水裝片，在光學顯微鏡下觀察菌絲的顏色、隔膜、分生孢子、載孢體形態等特征，測量大小并拍照，依據《真菌鑒定手冊》等資料鑒定[6-7，12-15，30-31]。

1.3.3 分子生物學技術鑒定。

采用CTAB法提取菌物的基因組DNA，利用引物ITS1（TCCGTAGGTGAACCTGCGG）和ITS4（TCCTCCGCTTATTGATATGC）擴增DNA的內轉錄間隔區（ITS）序列[7]。擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測確認后，送測序公司純化并測序。登陸BCBI網站與GenBank數據庫中相似模式菌株序列進行比對，獲得同源性較高的菌物，結合菌物的形態特征，參考相關文獻確定分離物的分類地位。

1.3.4 分離頻度測定。

為了確定分離物特別是病原菌的優勢種類，用以下公式計算分離頻度（document frequency，DF）：

DF=（分離物某屬或種的出現次數/分離總次數）×100%

1.3.5 致病性測定。

將分離物在PDA培養基上活化，待菌落上產生大量的分生孢子時，用無菌水沖洗孢子，3層無菌紗布過濾，濾液經5 000 r/min離心30 min后得到孢子沉淀，加無菌水稀釋成1.0×105個/mL孢子的懸浮液備用。

待草莓苗生長至4～5葉期時，用手術刀在根部造成輕微傷口，采用灌根法接種[13-14]，每株灌入25 mL孢子懸浮液。每種分離物重復3次，每重復1株苗。對照灌無菌水。接種后置于25 ℃光照培養箱培養（光照14 h/黑暗10 h）。期間澆水保持土壤濕潤。觀察草莓苗的變化，待出現明顯癥狀時取樣，用與上述相同的方法再次分離鑒定以完成柯赫氏法則驗證。

1.3.6 木霉對病原菌的拮抗效果及拮抗機理測試。

供試的4種木霉編號為Th1、Ta1、Th2和Th3，其中Th1、Th2和Th3為哈茨木霉（Trichoderma harzianum），Ta1為深綠木霉（Trichoderma aureoviride），保存于青島農業大學植物病理生理實驗室。

1.3.6.1 競爭作用。

制備PDA培養基平板，采用對峙培養法，在直徑9 cm的培養皿邊緣分別接種病原菌和木霉菌餅（直徑0.5 cm），2個菌餅相距5 cm，對照僅接種病原菌，每處理3個重復。接種后置于25 ℃恒溫箱中黑暗培養。分別于培養3、7 d時觀察木霉拮抗效果，根據下述分級標準說明其與病原菌的競爭作用[21]：Ⅰ，木霉菌絲占據平皿100%;

Ⅱ，木霉菌絲占據平皿>2/3;

Ⅲ，1/3<木霉菌絲占據平皿≤2/3;

Ⅳ，木霉菌絲占據平皿≤1/3;

Ⅴ，病原菌占據平皿100%。

1.3.6.2 拮抗互作。

在滅菌載玻片上滴一薄層2%水瓊脂，在間隔4 cm處分別接種木霉和病原菌菌絲體，接種后置于滅菌培養皿中，封口后置于25 ℃黑暗培養。分別于接種后不同時間取載玻片在光學顯微鏡下觀察木霉和病原菌菌絲間的溶菌、重寄生等作用。

1.3.6.3 抗生作用。

在滅菌PDA平板上平鋪無菌玻璃紙（直徑略大于培養皿底蓋），然后將木霉菌餅（Φ 0.5 cm）接種在玻璃紙中央，25 ℃黑暗培養，培養2.5 d時，用鑷子揭去玻璃紙及木霉菌餅，在培養基中央接種病原菌菌餅（Φ 0.5 cm），對照僅接種病原菌，所有處理重復3次，25 ℃黑暗培養。于接種3、7 d后測量菌落直徑，根據下式計算木霉對病原菌的抑菌率：

抑菌率=（對照菌落直徑-處理菌落直徑）/（對照菌落直徑-菌餅直徑）×100%

1.4 數據處理

試驗數據差異顯著性分析使用SAS 8.1數據分析軟件。

2 結果與分析

2.1 分離頻度

利用PDA培養基和OA培養基，從10個草莓種植地的30個采樣點共分離到6種分離物，編號分別為LX-1、LX-2、LX-3、LX-4、LX-5和LX-6，分離頻度由高到低依次為LX-1 45.8%、LX-2 32.1%、LX-3 8.4%、LX-4 6.9%、LX-5 4.6%、LX-6 2.3%。

2.2 形態學鑒定

根據分離物在PDA培養基上的菌落特征、菌絲、孢子及其載孢體的形態特征等，初步鑒定結果如下。

2.2.1 LX-1鑒定特征。

在PDA培養基上，菌落初為白色，后期變為灰色（圖1A），劃傷時在其上產生橘黃色分生孢子團。

分生孢子初單胞（圖1B），無色，多為長橢圓形，兩端鈍圓或一端呈錐形，具有2個油球，大?。?.9～11.2）μm×（3.9～4.8）μm，萌發時呈雙胞（圖1D）。

在菌絲上產生直立的分生孢子梗，在梗頂端形成芽生型分生孢子（圖1C）。分生孢子在2%葡萄糖水中萌發時產生1～4根芽管，在芽管頂端產生褐色的附著孢（圖1E）。

根據上述特征，將LX-1初步鑒定為炭疽菌（Colletotrichum spp.）。

2.2.2 LX-2鑒定特征。

在PDA培養基上，LX-2的菌落初期白色至淺粉色，氣生菌絲量大，菌落背面粉色，后期產生紫色色素（圖2A）。

產生大、小型分生孢子和厚垣孢子3種孢子（圖2B、C）。

氣生菌絲上的分生孢子梗多為單瓶梗（圖2D），較短，少見分枝（圖2E），通常產生大量假頭生小型分生孢子。小型分生孢子多為紡錘形或卵圓形，0～1隔，（3.7～12.8）μm×（2.5～5.2）μm。偶爾有2隔孢子。1～2隔分生孢子基部略縊縮，與大型分生孢子相似（圖2B）。

分生孢子座較易產生，淡黃色至橘黃色（圖2F）。大型分生孢子鐮刀形，有足胞，3～5隔，多為3隔，大?。?3.1～51.7）μm×（2.5～5.2）μm（圖2B）。

厚垣孢子易產生，單生或對生，間生或頂生，多為單生（圖2C）。

根據上述特征，將LX-2初步鑒定為鐮孢菌（Fusarium spp.）。

2.2.3 LX-3鑒定特征。

在PDA培養基上，氣生菌絲發達，菌落正面白色棉花狀，背面淡黃色，菌落邊緣不規則，波紋狀（圖3A）。后期在菌落正反面均產生黑色粒狀物，散生，為菌物的分生孢子盤及分生孢子（圖3B）。

分生孢子紡錘狀，直或稍彎，大?。?9.8～26.5）μm×（2.9～4.9）μm，具4個橫隔5個細胞，頂部和基部細胞無色透明，基部細胞具有1根附屬絲（3.0～6.5）μm，頂部細胞具有2～4根附屬絲，通常3根（14.5～22.5 μm）。中間3個細胞呈褐色（圖3C）。

根據上述特征，將LX-3初步鑒定為擬盤多毛孢（Neopestalotiopsis spp.）。

2.3 分子生物學技術鑒定

瓊脂糖凝膠電泳檢測結果表明，6種分離物ITS序列大小為300～1 000 bp。將測序結果在GenBank數據庫進行比對分析，待鑒定分離物ITS序列與模式菌同源性均高于99%。

結合形態學和分子生物學鑒定技術，6種分離物分別被鑒定為LX-1膠孢炭疽菌Colletotrichum? gloeosporioides（Penz.）Penz.& Sacc.（KM463758.1），LX-2尖孢鐮刀菌Fusarium oxysporum Schltdl.：Fr.（KT876659.1），LX-3新棒狀擬盤多毛孢Neopestalotiopsis clavispora（G.F.Atk.）Maharachch.，K.D.Hyde & Crous（FJ517545.1），LX-4枝狀枝孢Cladosporium cladosporioides（Fresen.）G.A.de Vries（HQ148094.1），LX-5菌核生枝頂孢Acremonium sclerotigenum（Moreau & R.Moreau ex Valenta）W.Gams（MH171928.1），LX-6土曲霉Aspergillus terreus Thom（KM103317.1）。

2.4 致病性測定

膠孢炭疽菌接種25 d后，其中1株草莓苗萎蔫，至第32天時，接種株全部萎蔫。尖孢鐮刀菌接種15 d后，供試3株草莓苗全部萎蔫。新棒狀擬盤多毛孢接種27 d后，其中1株苗萎蔫，至第37天時，接種株全部萎蔫。但枝狀枝孢、菌核生枝頂孢、土曲霉接種以及對照草莓苗均未發病。

再次從人工接種的草莓病根中分離到膠孢炭疽菌、尖孢鐮刀菌和新棒狀擬盤多毛孢，證明這三者為青島萊西地區草莓根腐病的病原菌，且前二者為優勢菌。

2.5 木霉對病原菌的拮抗效果及拮抗機理

2.5.1 競爭作用。

對峙培養3 d時，4株木霉的菌落與病原菌菌落接觸，拮抗效果達Ⅲ或Ⅳ級;培養7 d 時，4株木霉菌絲全覆蓋平皿，包括病原菌菌落，且在病原菌菌落上產孢，拮抗效果均達Ⅰ級。說明4株木霉具有很強的競爭作用。

2.5.2 拮抗互作。

載玻片上拮抗互作試驗未發現4株木霉與3種根腐病菌間有菌絲重寄生、溶菌等現象。

2.5.3 抗生作用。

病原菌在木霉非揮發性代謝產物培養基上培養3 d時，3種病原菌菌絲均未生長，抑菌率達100%;培養7 d時，抑菌率降低，但不同處理間抑菌率有顯著或極顯著差異（表1），4株木霉非揮發性代謝產物對3種病原菌均有一定的抑菌活性，但Ta1和Th2對3種病原菌抑菌活性高于其他2個木霉菌株，前者對膠孢炭疽菌、尖孢鐮刀菌和新棒狀擬盤多毛孢的抑菌率分別為74.1%、62.5%和75.0%，而后者分別為74.1%、73.8%和75.9%。說明Ta1和Th2具有一定的生防潛力。

3 結論與討論

Arx列出了約 600個膠孢炭疽菌（C.gloeosporioides）的異名，但大多被分子生物學技術證明屬于不同種[32]。該病原菌世界性分布，可侵染多個科的多種植物。在草莓上，中國、埃及、日本、韓國、美國及西班牙等國均有報道該病原菌可侵染草莓的根、莖、葉片、葉柄、匍匐莖、花和果實[32]。除膠孢炭疽菌（C.gloesporioides）外，尖孢炭疽菌（C.acutatum）和草莓炭疽菌（C.fragariae）侵染也可引起相似癥狀[4，6-7]。該研究從青島萊西地區草莓根腐病病組織中分離的膠孢炭疽菌，分離頻率達45.8%，為該地區草莓根腐病第一優勢病原菌。

尖孢鐮刀菌（F.oxysporum）是一種世界范圍內分布的病原真菌，可侵染多個科的多種植物，引起萎蔫、腐爛或猝倒等病害。在草莓上，中國、澳大利亞、保加利亞、美國、厄瓜多爾、伊朗、朝鮮、波蘭、塞爾維亞、西班牙及土耳其等國均報道該病原菌可引起草莓枯萎病或冠根腐[32]，且該病原菌存在草莓專化型（F.oxysporum f.sp.fragariae）[13]。在我國，草莓Fusarium根腐病分布十分廣泛，在各草莓栽培區均有分布[1，8]。在青島萊西地區，首次證實該病原菌可引起草莓根腐病，分離頻率達32.1%，是該地區的優勢根腐病菌之一。

新棒狀擬盤多毛孢（N.clavispora）是一種世界范圍內分布的病原真菌或內生真菌。作為病原菌，可侵染幾個科的幾種植物，引起葉斑、根腐或冠腐病[32]。在草莓上，阿根廷、意大利、韓國、西班牙、烏拉圭[32] 及中國[5]報道該病原菌引起草莓根冠腐。該研究分離的新棒狀擬盤多毛孢人工接種也證實了這點。

除上述3種病原菌外，還分離到3種真菌，分別為枝狀枝孢（C.cladosporioides）、菌核生枝頂孢（A.sclerotigenum）和土曲霉（A.terreus），分離頻率分別為6.9%、4.6%和2.3%。其中枝狀枝孢是一種腐生菌，廣泛分布于壞死的植物葉片、種子及花瓣等組織上，可引起植物葉斑、花腐、瘡痂等病害[32]。在草莓上，曾報道引起草莓花腐[33-34]。菌核生枝頂孢廣泛分布于土壤及各種腐殖質上，可引起套袋蘋果果實褐斑病[35-36]。土曲霉廣泛分布于多種植物基質上，可引起多種植物地上部分壞死和腐爛[37-38]。但致病性測定結果表明，上述3種真菌均不能引起草莓根腐病，為草莓根組織中的內生菌或腐生菌。

隨著草莓設施栽培面積的不斷擴大，由膠孢炭疽菌引起的炭疽根腐病、尖孢鐮刀菌引起的草莓枯萎病在我國主要草莓種植區普遍發生，危害程度逐年加重。草莓炭疽根腐病苗期主要危害地上部葉片、葉柄、匍匐莖和根莖，嚴重時致成片死苗。設施栽培的草莓，主要在定植后的緩苗期，以危害根莖為主，引起根莖腐，導致植株萎蔫和大量死苗，一般發病率為10%～20%，嚴重時達80%以上[4-7]。草莓枯萎病發病率嚴重時高達89.2%[8-9，12-13，31]。草莓新棒狀擬盤多毛孢根腐于2016年首次在青島城陽區和即墨區發生[5]，該研究調查時，雖然該病原菌分離率較低，僅為8.4%，但說明該病原菌在青島各草莓種區廣泛存在，應引起足夠的重視，以防在草莓苗遠距離調運過程中傳播到其他地區。

拮抗活性及拮抗機制測試結果表明，4株木霉與3種根腐病菌間無重寄生或溶菌現象，初步判斷4株木霉主要通過競爭作用和產生非揮發性代謝產物抑制病原菌的生長。其中Ta1和Th2對3種病原菌的抑菌活性高于Th1和Th3。減少化學殘留、提高食品安全，是整個草莓產業的當務之急。在后續的試驗中將進行木霉對活體草莓根腐病的生防效果試驗。

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