祛白片正丁醇部位對脫黑色素細胞模型的藥效學研究

段松冷 顧紅燕 年宏蕾 邢若 曾蔚欣

中圖分類號 R965 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2022）09-1049-07

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2022.09.05

摘 要 目的 研究祛白片正丁醇部位的化學成分，以及其對脫黑色素細胞模型的藥效作用。方法 制備祛白片正丁醇部位。采用超高效液相色譜-質譜聯用（UPLC-MS）技術分析其化學成分。以小鼠B16黑色素瘤細胞為研究對象，建立脫黑色素細胞模型后分為模型組、陽性對照不同濃度組（8-甲氧補骨脂素10、50、100、150、200 μmol/L）、溶媒組（以DMSO稀釋而得）和祛白片正丁醇部位不同濃度組（10、50、100、150、200 μg/mL），采用倒置顯微鏡觀察細胞數量變化，并檢測細胞增殖率、促黑色素生成率、酪氨酸酶活性促進率。結果 在正、負離子模式下初步確定了祛白片正丁醇部位的53個化合物（正離子模式下29個，負離子模式下33個，重合9個），其中香豆素類化合物所占比例最大，其次是黃酮類化合物。祛白片正丁醇部位可使細胞數明顯增加，且與作用時間和給藥濃度呈正相關;其可顯著升高細胞的增殖率、促黑色素生成率、酪氨酸酶活性促進率（P<0.01）。結論 香豆素類和黃酮類化合物可能是祛白片正丁醇部位發(fā)揮抗白癜風作用的物質基礎;祛白片正丁醇部位的抗白癜風作用可能是通過促進酪氨酸酶活性實現的。

關鍵詞 祛白片;正丁醇部位;白癜風;超高效液相色譜-質譜聯用;黑色素;酪氨酸酶

n-butanol part from Qubai tablet and study on its pharmacodynamics to de melanocyte model

DUAN Songleng1，2，GU Hongyan1，2，NIAN Honglei1，2，XING Ruo1，2，ZENG Weixin1，2（1. Dept. of Pharmacy， Beijing Shijitan Hospital Affiliated to Capital Medical University， Beijing 100038， China; 2. Beijing Key Laboratory of Evaluation of Rational Drug Use， Beijing 100038， China）

ABSTRACT ? OBJECTIVE To study the chemical constituents of n-butanol part of Qubai tablet and its pharmacodynamic effect on the model of de melanocyte. METHODS The n-butanol part of Qubai tablet was prepared. The chemical constituents were analyzed by ultra-high performance liquid chromatography-mass spectrometry （UPLC-MS）. Taking mice B16 melanoma cells as the research object， the de melanocyte model was established and divided into model group， positive control different concentration groups （8-methoxypsoralen 10， 50， 100， 150， 200 μmol/L）， solvent group （diluted with DMSO） and Qubai tablet n-butanol part different concentration groups （10， 50， 100， 150， 200 μmol/L）. The number of cells were observed by inverted microscope， and the cell proliferation rate， the rate of melanin production and promotion rate of tyrosinase activity were also detected. RESULTS In the positive and negative ion mode， 53 compounds in the n-butanol part of Qubai tablet were preliminarily determined （29 in the positive ion mode， 33 in the negative ion mode， overlapping 9）， of which coumarins accounted for the largest proportion， followed by flavonoids. The n-butanol part of Qubai tablet could significantly increase the number of cells， which was positively correlated with the action time and administration concentration. It could significantly increase the proliferation rate of cells， the rate of melanin production and promotion rate of tyrosinase activity （P<0.01）. CONCLUSIONS Coumarins and flavonoids may be the material basis for the anti-vitiligo effect of n-butanol part from Qubai tablet; anti-vitiligo effect of n-butanol part of Qubai tablet may be realized by promoting tyrosinase activity.

KEYWORDS ? Qubai tablet; n-butanol part; vitiligo; UPLC- MS; melanin; tyrosinase

醫(yī)院制劑祛白片（京藥制字Z20063383）因療效好、患者需求大，一直是首都醫(yī)科大學附屬北京世紀壇醫(yī)院藥學研發(fā)團隊研究的重點[1-2]。為使更多的白癜風患者受益，醫(yī)院擬將祛白片進行成果轉化。本課題組前期研究了祛白片全方、揮發(fā)油和乙酸乙酯部位的初步藥效學，證實了這些部位均具有較好的抗白癜風作用，且重點分析了揮發(fā)油和乙酸乙酯部位的化學成分[3-5]。為更全面地解決患者提出的該藥服藥劑量大的問題（說明書中規(guī)定：每次5片，每日3次），本課題組又富集了祛白片正丁醇部位，在前期研究的基礎上，采用超高效液相色譜-質譜聯用（ultra-performance liquid chromatography- mass spectrometer，UPLC-MS）技術初步確定其化學成分，并從細胞數量、促細胞活力、促黑色素生成3個方面研究祛白片正丁醇部位對脫黑色素細胞模型的藥效學，以期為該制劑的進一步藥理機制研究和制備工藝優(yōu)化提供依據。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有Q ExactiveTM型四極桿軌道離子阱質譜、DionexTM UltiMateTM 3000型UPLC儀、Multiskan FC型酶標儀（美國Thermo Fisher Scientific公司），COIC XDS-1B型顯微鏡（重慶重光實業(yè)有限公司），RT-TDL-40B型離心機（無錫市瑞江分析儀器有限公司），YT-CJ-1ND型無菌操作臺（北京亞泰科隆儀器技術有限公司），MCO-15AC型CO2培養(yǎng)箱（日本Panasonic公司）。

1.2 主要藥品與試劑

炒蒺藜、補骨脂、黑芝麻等15味中藥飲片均購自北京金崇光藥業(yè)有限公司，經我院藥檢室檢驗符合2020年版《中國藥典》（一部）要求[6];8-甲氧補骨脂素（8- ?methoxypsoralen，8-MOP，批號M3501-1G）、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO，批號D2650）、過氧化氫（H2O2，批號H1009-100）和左旋多巴（L-DOPA，貨號72816）均購自美國Sigma公司，DMEM培養(yǎng)基（批號C11965500BT）購自美國Invitrogen公司;其余試劑為實驗室常用規(guī)格，水為純凈水。

1.3 細胞

小鼠B16黑色素瘤細胞（編號3111C0001CCC000324）購自中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所基礎醫(yī)學細胞中心。

2 方法與結果

2.1 祛白片正丁醇部位成分的UPLC-MS分析

2.1.1 樣品的制備 取炒蒺藜、補骨脂、黑芝麻等15味中藥飲片，加水煎煮3次，每次1 h，濾過;合并煎液，濃縮，即得祛白片干浸膏。參考文獻[7]方法，取祛白片干浸膏適量，充分溶解于熱水，用等體積正丁醇分3次萃取，合并萃取液，濃縮，即得祛白片正丁醇部位干浸膏。取適量祛白片正丁醇部位干浸膏用甲醇充分溶解，待測。

2.1.2 UPLC-MS條件 （1）色譜條件：色譜柱為Waters UPLC HSS T3（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）;流動相為A相（水，含有0.05%乙酸和1 mmol/L乙酸銨）-B相[異丙醇-乙腈混合液（1 ∶ 1，V/V）]，梯度洗脫（0～3 min，10% B→35% B;3～6 min，35% B→85% B;6～8 min，85% B→100% B;8～11 min，100% B;11～11.1 min，100% B→10% B;11.1～13 min，10% B）;流速為0.3 mL/min，柱溫為50 ℃。（2）質譜條件：正、負離子源電壓分別為3.7、3.5 kV;碰撞氣為氮氣，壓力為1.5 mTorr;鞘氣和輔助氣均為氮氣，鞘氣壓力為30 psi，輔助氣壓力為10 psi;毛細管加熱溫度為320 ℃;容積加熱蒸發(fā)溫度為300 ℃。一級全掃描參數：分辨率為7×105，自動增益控制目標為3×106，最大隔離時間為100 ms，質荷比（m/z）掃描范圍為50～1 500。本研究進行正、負離子模式下的全掃描檢測。

2.1.3 UPLC-MS分析及結果 取“2.1.1”項下祛白片正丁醇部位待測樣品，按“2.1.2”項下色譜與質譜條件進樣分析，得正、負離子模式下祛白片正丁醇部位的總離子流圖，結果見圖1。將采集好的數據用 Progenesis QI軟件處理，依次進行原始數據導入、峰對齊、峰提取、歸一化處理，最后通過m/z、保留時間、峰強度等信息，在正、負離子模式下初步確定了祛白片正丁醇部位的53個化合物（正離子模式下29個，負離子模式下33個，重合9個），結果見表1、表2。

2.2 脫黑色素細胞模型的藥效學研究

2.2.1 供試品溶液的制備 精密稱取0.1 g祛白片正丁醇部位干浸膏，加不含血清的 DMEM 培養(yǎng)基定容至10 mL，再以0.22 μm微孔濾膜過濾，即得祛白片正丁醇部位母液，臨用時稀釋成所需濃度作為供試品溶液。

2.2.2 脫黑色素細胞模型的建立 參考文獻[8]方法，將小鼠B16黑色素瘤細胞于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，將培養(yǎng)基更換為含0.1 mmol/L H2O2的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，吸棄培養(yǎng)基，即得脫黑色素細胞模型。

2.2.3 細胞數量觀察 取對數生長期小鼠B16黑色素瘤細胞，經胰酶消化后，制成單細胞懸液（1×104 個/mL），接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100 μL，按“2.2.2”項下方法建立脫黑色素細胞模型，然后分為模型組、陽性對照不同濃度組（8-MOP，10、50、100、150、200 μmol/L，以DMSO溶解，濃度根據文獻[5]設置，下同）、溶媒組（由于8-MOP以DMSO溶解，故本實驗另設DMSO溶媒組，即以DMSO稀釋1×104倍）和祛白片正丁醇部位不同濃度組（10、50、100、150、200 μg/mL，質量濃度根據參考文獻[5]設置）。模型組細胞加入DMEM培養(yǎng)基，其余各組加入相應藥物或溶劑，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24、48 h后，采用倒置顯微鏡觀察各組細胞數量變化。結果見圖2。

由圖2可知，與模型組比較，祛白片正丁醇部位各濃度組細胞數均明顯增加，且與作用時間和給藥濃度呈正相關。其中，200 μg/mL的祛白片正丁醇部位（作用48 h后）使黑色素細胞數量增加最明顯。與溶媒組比較，8-MOP各濃度組細胞數也明顯增加，也與作用時間和給藥濃度呈正相關。

2.2.4 細胞活性檢測 采用CCK-8法檢測細胞的活性。取對數生長期小鼠B16黑色素瘤細胞，按“2.2.3”項下方法接種、造模、分組與給藥，另設只加培養(yǎng)基、不加細胞的本底對照組，每組設5個復孔。各組細胞培養(yǎng)24、48 h后，吸去上清液，加入 CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，采用酶標儀于450 nm波長處測定各孔光密度值（OD），并取平均值，再計算細胞增殖率[細胞增殖率=（OD給藥組-OD本底對照組）/（OD模型組或溶媒組-OD本底對照組）×100%[9]]。采用SPSS 22.0 軟件對數據進行統(tǒng)計分析。計量資料以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，檢驗水準α=0.05。結果顯示，與模型組比較，祛白片正丁醇部位各濃度組細胞增殖率均顯著升高（P<0.01）;與溶媒組比較，8-MOP各濃度組細胞增殖率均顯著升高（P<0.01）。結果見圖3。

2.2.5 促黑色素生成率的檢測 參考文獻[10]方法進行檢測。取對數生長期小鼠B16黑色素瘤細胞，按“2.2.3”項下方法接種、造模、分組與給藥，每組設5個復孔。各組細胞培養(yǎng)24、48 h后，棄去上清液，以磷酸鹽緩沖液（pH=7.4）清洗2次后，加入1 mol/L NaOH溶液（不含DMSO）200 μL，于80 ℃條件下恒溫水浴2 h，待細胞充分裂解、黑色素顆粒充分溶解后，采用酶標儀于490 nm波長處測定各孔OD，并取平均值，再計算促黑色素生成率[促黑色素生成率=（OD給藥組-OD模型組或溶媒組）/OD模型組或溶媒組×100%]。結果顯示，與模型組比較，祛白片正丁醇部位各濃度組細胞促黑色素生成率均顯著升高（P<0.01）;與溶媒組比較，8-MOP各濃度組細胞促黑色素生成率也顯著升高（P<0.01）。結果見圖4。

2.2.6 酪氨酸酶活性促進率的檢測 參考文獻[11]方法進行檢測。取對數生長期小鼠B16黑色素瘤細胞，按“2.2.3”項下方法接種、造模、分組與給藥，每組設5個復孔。各組細胞培養(yǎng)24、48 h后，棄去培養(yǎng)基，以磷酸鹽緩沖液（pH=7.4）洗滌2次，每孔加入TritonX-100溶液（1%）90 μL，立即放入-80 ℃冰箱冷凍30 min，取出后室溫融化至細胞完全破裂，37 ℃預溫后加入L-DOPA溶液（10 g/L）100 μL，于37 ℃條件下孵育30 min后，采用酶標儀于490 nm波長處檢測各孔OD，并取平均值，再計算酪氨酸酶活性促進率[酪氨酸酶活性促進率=（OD給藥組-OD模型組或溶媒組）/OD模型組/溶媒組×100%]。結果顯示，與模型組比較，祛白片正丁醇部位各濃度組細胞酪氨酸酶活性促進率均顯著升高（P<0.01）;與溶媒組比較，8-MOP各濃度組細胞酪氨酸酶活性促進率也顯著升高（P<0.01）。結果見圖5。

3 討論

3.1 中藥有效部位篩選

中藥有效部位指從中藥中提取出的一類或幾類化學成分的混合物，是發(fā)揮療效的物質基礎，也是質量控制的關鍵。通過分離純化除去無效、低效或有毒的成分，來降低服用劑量和毒副作用，是中藥創(chuàng)新藥物發(fā)現的重要途徑[12-13]。中藥有效部位的研究內容為對中藥或其制劑進行系統(tǒng)提取分離，根據功效采用相應藥理學指標建立藥理模型，確定具有活性的部位，同時采用現代分析手段確定該部位所含化學成分的類型。中藥有效部位的確定是中藥新藥研究開發(fā)的基礎[14]。近年來，多項國內外研究表明，中藥有效部位的提取與篩選，對揭示中藥多組分、多靶點、多途徑的特點及中藥復方配伍內在規(guī)律具有重要意義[15-17]。本文遵循中藥有效部位研究方法，旨在確定祛白片的活性部位，為進一步研發(fā)抗白癜風藥物奠定基礎。

3.2 祛白片正丁醇部位化學成分分析

中藥正丁醇部位化學成分和生物活性一直是近年來中藥化學研究的熱點[18-20]。本研究利用UPLC-MS技術，初步確定了祛白片正丁醇部位所含的53個化合物（正離子模式下29個，負離子模式下33個，重合9個），并計算了相對百分含量。正離子模式下相對百分含量排名前3位的化合物分別為7-O-（3，3-二甲基烯丙基）-東莨菪素（34.37%）、比克白芷素（18.12%）和黃決明素（8.73%）;負離子模式下相對百分含量排名前3位的化合物分別為十六（烷）酸（28.35%）、十八碳酸（27.51%）和柚皮苷（24.12%）。另外，在正、負離子模式下均檢出的9種化合物分別為苜蓿素、比克白芷素、黃決明素、補骨脂色烯查爾酮、異歐前胡內酯、補骨脂異黃酮、補骨脂甲素、8-牻牛兒醇基補骨脂素、柳杉醇。在這些成分中，香豆素類化合物所占比例最大，黃酮類化合物次之，這與本課題組前期對祛白片乙酸乙酯部位化學成分研究結果類似[4]。但祛白片正丁醇部位中有7種成分在乙酸乙酯部位中未檢出，分別為辛弗林、苜蓿素、柚皮苷、丹酚酸C、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、大黃素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷、苜蓿素和十六（烷）酸。經查閱文獻發(fā)現，香豆素類和黃酮類化合物均具有潛在的抗白癜風作用[21-23]，值得進一步深入研究。

3.3 脫黑色素模型的藥效學結果分析

小鼠B16黑色素瘤細胞目前在藥理學研究中被廣泛應用[24-25]。本實驗利用小鼠B16黑色素瘤細胞建立脫黑色素細胞模型，從細胞數量、促細胞活力、促黑色素生成3個方面，研究了祛白片正丁醇部位的藥效學。首先，采用倒置顯微鏡觀察細胞的數量變化，結果發(fā)現，祛白片正丁醇部位可使細胞數明顯增加，且增加趨勢與作用時間和給藥濃度呈正相關。其次，研究了祛白片正丁醇部位對細胞活性的影響，結果發(fā)現，祛白片正丁醇部位可顯著提高細胞的增殖率（P<0.01）。為進一步探索祛白片正丁醇部位的作用機制，本研究檢測其對酪氨酸酶活性的影響，結果發(fā)現，祛白片正丁醇部位可顯著升高酪氨酸酶活性促進率，由此推測，該部位具有潛在的抗白癜風作用，且可能是通過提高酪氨酸酶活性實現的。結合本課題組前期研究發(fā)現，祛白片乙酸乙酯部位也具有良好的抗白癜風作用，這提示在后續(xù)研究中可優(yōu)化祛白片原有制備工藝，將祛白片水煎液用乙酸乙酯和正丁醇分別萃取后，合并兩部位制備成制劑，以達到既保留原有藥效、又減小服用劑量的效果，從而更好地提高患者的依從性。

綜上所述，香豆素類和黃酮類化合物可能是祛白片正丁醇部位發(fā)揮抗白癜風作用的物質基礎;祛白片正丁醇部位的抗白癜風作用可能是通過促進酪氨酸酶活性實現的。

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（收稿日期：2021-12-29 修回日期：2022-03-29）

（編輯：唐曉蓮）