高效液相色譜法測定綠豆糕中的脫氫乙酸

◎ 王歲歲

（馬鞍山市產品質量監督檢驗所，安徽 馬鞍山 243000）

脫氫乙酸（Dehydroacetic Acid，DA），別名二乙酰基乙酰乙酸，性狀為無色至白色針狀或板狀結晶或白色結晶粉末，無臭，略帶酸味，不易溶于水，易溶于堿性溶液。脫氫乙酸飽和水溶液pH=4。脫氫乙酸具有很好的防腐、防霉效果[1-3]，其中對霉菌和酵母的抑菌能力最強[4]。脫氫乙酸常作為防腐劑被用于腐乳、 醬菜、糕點等食品中。食入的脫氫乙酸達到一定的劑量后，對人體具有潛在危害[5]。因此，準確檢測食品中的脫氫乙酸含量對把控脫氫乙酸的攝入量具有重要意義。

目前國標中檢測食品中脫氫乙酸的方法主要有氣相色譜法[6-7]和液相色譜法[8-11]。其中，液相色譜法前處理煩瑣而低效，重現性不好，且易出現峰拖尾、分叉等現象，不利于脫氫乙酸的定性及定量。脫氫乙酸電離常數較低，不同的酸堿條件可能影響脫氫乙酸的出峰效果[12]。因此，本研究以綠豆糕為樣品，基于高效液相色譜法，建立簡單易操作的脫氫乙酸檢測方法，并考察流動相的pH值升高對脫氫乙酸峰形的改善作用，為今后快速有效檢測食品中的脫氫乙酸提供重要的參考價值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗樣品：綠豆糕，市場購買。

脫氫乙酸標準品：TMstandard，批號21060503；沉淀劑1：亞鐵氰化鉀溶液，稱取106 g亞鐵氰化鉀，用水溶解并定容到1 000 mL；沉淀劑2：乙酸鋅溶液，稱取220 g乙酸鋅用少量水溶解，加入30 mL冰乙酸，用水定容到1 000 mL；氫氧化鈉溶液（20 g·L-1）：稱取20 g氫氧化鈉溶于水中，并定容到1 000 mL；甲醇：色譜純；乙酸銨溶液（0.02 mol·L-1）：稱取1.54 g乙酸銨，用水溶解并定容至1 000 mL。

1.2 儀器與設備

島津LC-20AT高效液相色譜儀（配有二極管陣列檢測器）：日本島津科學儀器公司；AL204電子天平：賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；CQ-300B-S超聲波清洗機：上海躍進醫用光學器械廠；ST5000/F pH計：奧豪斯儀器（常州）有限公司；HC-3018R冷凍離心機：安徽中科中佳科學儀器有限公司；針式濾膜：水相濾膜，0.22 μm；Angilent HC-C18色譜柱，250 mm×4.6 mm，5 μm。

1.3 方法

1.3.1 實驗基本條件

本實驗選用Angilent HC-C18色譜柱（pH耐受范圍為2～9）；流動相為甲醇∶乙酸銨（0.02 mol·L-1）=7 ∶ 93；流速為 1.0 mL·min-1，進樣量為 10 μL。

1.3.2 標準曲線的建立

準確稱取0.250 0 g脫氫乙酸標準品。用5 mL氫氧化鈉溶液（20 g·L-1）溶解后，用水定容至25 mL，即為1 000 μg·mL-1的標準儲備液。將標準儲備液用水 逐 步 稀 釋 至 1 μg·mL-1、10 μg·mL-1、20 μg·mL-1、50 μg·mL-1和 100 μg·mL-1的標準系列濃度。

1.3.3 樣品前處理

稱取綠豆糕約2 g置于50 mL離心管中，加水30 mL，混勻后分別加入3 mL沉淀劑1和3 mL沉淀劑2，混勻，用20 g·L-1的氫氧化鈉溶液調節樣液酸堿值，用pH試紙測試，調至pH=7～8；超聲提取20 min后，4 000 r·min-1離心5 min，將上清液轉移至50 mL容量瓶中，用水定容，取適量過0.22 μm的濾膜，待上機。

1.3.4 流動相pH值的調節

用氫氧化鈉溶液調節乙酸銨溶液的pH值，用pH計測定。分別調節至pH=7.5、pH=8.0、pH=8.5和pH=9.0共4個梯度。

1.3.5 加標回收實驗

以綠豆糕為本底，添加3個不同濃度的脫氫乙酸標準溶液，檢測其脫氫乙酸值，每個濃度做5個平行，計算平均回收率及相對標準偏差。

2 結果與分析

2.1 檢測波長的選擇

利用二極管陣列檢測器進行全波長掃描，結果發現脫氫乙酸的最大吸收波長為293 nm。

2.2 流動相pH值對脫氫乙酸峰形的影響

由圖1可知，未調節乙酸銨溶液pH值前，脫氫乙酸峰拖尾、不對稱，影響脫氫乙酸的定性和定量。將乙酸銨溶液pH值調至7.5時，脫氫乙酸峰依舊拖尾嚴重，如圖2。繼續調高乙酸銨溶液pH值至8.0，如圖3所示，脫氫乙酸峰仍舊有拖尾現象，但相比于圖1和圖2，峰拖尾現象有所減緩。調節乙酸銨溶液pH值至8.5，脫氫乙酸出峰效果如圖4所示，此時脫氫乙酸峰形良好，峰尖銳且對稱，無拖尾現象。當乙酸銨溶液pH值調至9.0時，結果如圖5所示，脫氫乙酸峰形良好，無拖尾現象，與圖4相比無顯著差別。由上說明，乙酸銨溶液的pH值高低對調節脫氫乙酸的峰形有一定的作用，在一定范圍內，pH值越高，峰形越好，拖尾現象越不明顯。當pH值達到8.5時，峰形達到最優，繼續升高乙酸銨溶液pH值，峰形無顯著變化，結合色譜柱的酸堿耐受性（pH<9），因此選擇乙酸銨溶液pH=8.5為最佳實驗條件。

圖1 脫氫乙酸20 μg·mL-1色譜圖（未調節pH值）

圖2 脫氫乙酸20 μg·mL-1色譜圖（pH=7.5）

圖3 脫氫乙酸20 μg·mL-1色譜圖（pH=8.0）

圖4 脫氫乙酸10 μg·mL-1色譜圖（pH=8.5）

圖5 脫氫乙酸 20 μg·mL-1色譜圖（pH=9.0）

2.3 脫氫乙酸標準曲線

將脫氫乙酸標準系列濃度在上述實驗條件下上機進樣，得到標準曲線如圖6所示。由圖6可知，在1～100 μg·mL-1濃度范圍內，脫氫乙酸響應值與濃度之間呈現良好的線性關系，回歸方程為y=31 923x，其線性相關性系數R2=0.999 9。

圖6 脫氫乙酸標準曲線圖

2.4 方法回收率及相對標準偏差確定

將處理好的綠豆糕樣品溶液在上述實驗條件下測定，根據脫氫乙酸標準曲線定量，計算得綠豆糕中脫氫乙酸的含量為 0.260 g·kg-1。分別添加 0.10 g·kg-1、0.20 g·kg-1、0.30 g·kg-1濃度的脫氫乙酸標準品于綠豆糕中，測定其回收率，結果如表1所示。

由表1可知，在本實驗條件下綠豆糕的加標回收率為95%～100%，相對標準偏差為1.2%～1.7%。說明此方法結果值可信，具有一定的可操作性。

表1 綠豆糕加標回收率測定表

3 結論

本實驗探討了簡便且適用的檢測綠豆糕中脫氫乙酸的方法。實驗結果表明，脫氫乙酸在293 nm處得到最大吸收峰。流動相設為甲醇∶0.02 mol·L-1乙酸銨=7∶93，能很好地將脫氫乙酸與糖精鈉等干擾峰分離。增大乙酸銨溶液的pH值，脫氫乙酸的峰形逐漸被改善，拖尾現象得到緩解，說明乙酸銨溶液的酸堿度在一定范圍內對調節脫氫乙酸的出峰效果起到了很大作用。將乙酸銨溶液pH值調至8.5，脫氫乙酸峰形尖銳且對稱，能達到最優的出峰效果，解決了以前脫氫乙酸峰拖尾及出現鬼峰等現象。對綠豆糕進行加標回收實驗，得到回收率為95%～100%，說明此方法具有一定可操作性。

綜上所述，本實驗中基于高效液相色譜法檢測綠豆糕中脫氫乙酸的方法，具有簡單易操作、快速、出峰效果好、結果值可信以及重復性好等特點，適用于檢測食品中的脫氫乙酸含量。