高效液相色譜法測定黃瓜中雙炔酰菌胺殘留量

◎ 黎 東，張周莉，雍 萍，廖 蘭，易 達

（南充市食品藥品檢驗所，四川 南充 637000）

隨著國內外社會經濟逐漸發展，食品安全備受人們關注，農藥殘留已為食品安全問題的關注焦點之一。農藥在防蟲、防害、保護及促進農作物生長的同時伴隨著超量使用甚至濫用，造成的農藥殘留量超標問題對人們的生活環境和身體健康造成嚴重的威脅。據統計，我國2020年農藥行業規模以上企業化學農藥原藥（100%）產量為225.4萬t，國內農藥使用量為145.6萬t，已躍居全球最大的農藥生產使用國。世界衛生組織統計，每年全球由于農藥殘留受到健康影響人數約為300萬人，其中中毒致死人數約為30萬人，農藥殘留產生的食品安全問題頻頻發生[1]。

雙炔酰菌胺殺菌劑是近幾年國外公司開發的一種新型羧酸酰胺類卵菌病毒殺菌劑，針對黃瓜霜霉菌、葡萄霜霉病、辣椒疫霉病、馬鈴薯晚疫病和番茄晚疫病等靠氣流傳播、潛伏期長、發病迅猛、浸染速度快的病菌具有無交互抗性、效果好、活性高、持效期長、殺菌譜廣的特點[2]。近幾年市場成長性非常好，2009—2014年復合年增長率為58.5%。隨著雙炔酰菌胺的大量使用，雙炔酰菌胺農藥殘留逐漸引起人們關注，國外發達國家及我國標準和法規對該類農藥制定了最高殘留限量。我國最新頒布的食品安全國家標準GB 2763—2021規定了黃瓜中雙炔酰菌胺殘留量，但未推薦相應的檢測方法[3]。目前報道的果蔬中雙炔酰菌胺檢測方法主要為液質法，具有設備昂貴、操作難度大、人員要求高等缺點，蔬菜中雙炔酰菌胺高效液相色譜檢測方法亦未見報道[4-5]。

本文采用乙腈提取樣品，分散固相萃取凈化提取液，高效液相色譜法為檢測方法，建立了黃瓜中雙炔酰菌胺殘留量的定性及定量分析方法，該方法具有操作簡便快捷、準確度高、穩定性好等特點，可以作為雙炔酰菌胺定性及定量檢測的參考方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

標準品：雙炔酰菌胺，純度99.28%，德國Dr.E；乙腈，色譜純，諾爾施；無水硫酸鎂，成都科隆，分析純；氯化鈉，分析純，成都科??；檸檬酸鈉二水合物（C6H5Na3O7·2H2O），分析純，國藥集團；檸檬酸二鈉鹽倍半水合物（C6H5Na3O7·1.5H2O），分析純，國藥集團；乙二胺-N-丙基硅烷化硅膠（PSA），粒徑：40～60 μm，逗點生物；十八烷基硅烷鍵合硅膠（C18），粒徑：40～60 μm，逗點生物；石墨化炭黑（GCB），40～120 μm，逗點生物；陶瓷均質子，2 cm（長）×1 cm（外徑），逗點生物；微孔濾膜，13 mm×0.45 μm，津騰。

1.2 儀器與設備

DIONEX UHPLC+Ultimate 3000型高效液相色譜儀，美國Thermo公司；Multi-Reax型渦旋振蕩器，德國heidolph；5810R型冷凍離心機，德國eppendorf公司；KQ-700DE型超聲儀，昆山市超聲儀器有限公司；N1-50型氮吹濃縮儀，上海屹堯儀器科技發展有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 標準溶液配制

稱取適量（精確至0.000 1 g）的雙炔酰菌胺標準物質，用乙腈溶解配制濃度為290 0 μg·mL-1左右的標準儲備液，保存于-18 ℃冰箱內。進行試驗時，以50%乙腈水溶液作為稀釋劑，用標準儲備液配制出濃度分別為 0 μg·mL-1、2.90 μg·mL-1、7.25 μg·mL-1、14.50 μg·mL-1、29.00 μg·mL-1、58.00 μg·mL-1、116.00 μg·mL-1、174.00 μg·mL-1、232.00 μg·mL-1和290.00 μg·mL-1的溶劑標準工作液。

1.3.2 試樣采集及制備

在農貿市場隨機采集黃瓜樣品3份，每份1 kg，將采集后的樣品切碎，充分混勻，四分法取一部分后用組織搗碎機勻漿，放入聚乙烯瓶中，于18 ℃條件下保存。

1.3.3 樣品前處理步驟

稱取約10 g（精確至0.01 g）試樣于50 mL塑料離心管中，加入10 mL乙腈，高速勻漿3 min，加入4 g無水硫酸鎂，1 g氯化鈉，1 g檸檬酸鈉二水化合物，0.5 g檸檬酸二鈉鹽倍半水化合物，劇烈振蕩1 min，4 200 r·min-1離心5 min。定量吸取5 mL上清液至內含除水劑和凈化材料的塑料離心管中（每毫升提取液使用150 mg無水硫酸鎂、25 mg PSA、2.5 mg GCB），渦旋混勻1 min。4 000 r·min-1離心5 min，吸取上清液過0.45 μm有機微孔濾膜，待測定。

1.3.4 液相色譜儀器條件

色譜柱：中譜紅RD-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL；流動相：流動相A為水，流動相B為乙腈，A∶B=50∶50；檢測波長：223 nm。

2 結果與分析

2.1 色譜條件選擇

通過DIONEX UHPLC+Ultimate 3000型高效液相色譜儀二極管陣列檢測器紫外波長全掃描功能，獲得雙炔酰菌胺的紫外全波長掃描圖1，從圖中可以看到雙炔酰菌胺紫外最大吸收波長在195 nm及223 nm附近，波長195 nm附近具有較大的溶劑干擾，將檢測波長定為223 nm可保障雙炔酰菌胺具有較大吸收峰同時基質干擾較輕。色譜柱對比了中譜紅RD-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm） 和 Ailent Eclipse Plus C8（150 mm×4.6 mm，3.5 μm）2種色譜柱的分離效果和儀器響應。結果表明，雙炔酰菌胺在中譜紅RD-C18柱子上具有較好的峰形和重現性，雙炔酰菌胺標準品色譜圖見圖2，而Ailent Eclipse Plus C8分離度低，出峰時間過快。因此本實驗最終選擇中譜紅RD-C18分離待測物質。雙炔酰菌胺化學性質為弱極性，用乙腈作為溶劑溶解樣品，并選擇乙腈和水作為流動相，為得到更好的分離效果和峰形，將流動相按不同比例在色譜柱上進行試驗，最終確定流動相為乙腈∶水=50∶50，在流速1.0 mL·min-1時，對雙炔酰菌胺目標物質及雜質能夠進行很好的分離，具有分離度高、峰形對稱因子高、基線平穩及分析時間短等特點，提高了工作效率。

圖1 雙炔酰菌胺的紫外全波長掃描圖

圖2 雙炔酰菌胺標準品色譜圖

2.2 樣品提取及凈化

本實驗以乙腈作為樣品提取溶劑，比較了勻漿3 min、陶瓷均質子振蕩5 min及超聲20 min 3種樣品溶液提取方式，確定勻漿3 min加標樣品可得到較高的回收率。利用便捷快速前處理方法對樣品進行提取，在均質機中將提取劑和樣品充分勻漿后，再加入硫酸鎂、氯化鈉、檸檬酸鈉二水合物、檸檬酸二鈉鹽倍半水合物，提取時加入硫酸鎂脫除樣品溶液中的水分。加入氯化鈉、檸檬酸鈉二水合物、檸檬酸二鈉鹽倍半水合物可以通過鹽析作用提升提取效率，實驗表明該方法可較好地將樣品中雙卻菌酰胺提取完全。QuEChERS法檢測農殘的前處理過程中應用廣泛，實驗關鍵點在于選擇分散固相萃取材料的品種和用量。通過考察GCB、C18、PSA 3種種常見的基質分散萃取材料，實驗表明，GCB凈化效果最明顯，但是對雙炔酰菌胺也會有一定程度的吸附，導致回收率較低，而PSA和C18對藥物的吸附不顯著，同時也有足夠的凈化能力，PSA對蔬菜水果樣品基質凈化能力高于C18，最后選擇以PSA為主以GCB為輔作為萃取凈化試劑。使用不同用量的PSA和GCB處理提取液，最后確定凈化每毫升提取液時，以25 mg PSA、2.5 mg GCB作為萃取凈化試劑比較合適。

2.3 方法線性關系、線性范圍及檢出限

將配制的標準系列工作溶液在上述色譜操作條件下進行分析，以雙炔酰菌胺標準溶液濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線，檢測方法線性方程式為Y=0.452 0X+0.321 3、相關系數R2為0.999 9，線性范圍為 0.145 ～ 290.0 μg·mL-1。在樣品中按照 7.25 mg·kg-1濃度加標，根據建立的檢測方法測得結果，檢出限LOD以信噪比3倍進行計算，定量限以信噪比10倍進行計算，得到馬鈴薯中3種農藥檢出限為0.01 mg·kg-1及定量限為0.03 mg·kg-1.

2.4 方法回收率和精密度

準確稱取10.0 g陰性黃瓜于50 mL離心管中，分別添加一定量的雙炔酰菌胺標準溶液，使添加濃度 水 平 為 0.03 mg·kg-1、0.30 mg·kg-1、5.80 mg·kg-1、29.00 mg·kg-1于冰箱中冷藏過夜后按所建立方法處理測定。每個添加濃度重復6次，計算回收率和精密度，結果見表1。由表1可見，在0.03～29.00 mg·kg-1范圍內，黃瓜中雙炔酰菌胺添加的回收率為82.5%～94.5%；相對標準偏差在0.64%～4.80%，方法具有良好的準確度和精密度。

表1 方法回收率和精密度測定結果表（n=6）

3 結論

本研究建立了高效液相色譜法測定黃瓜中雙炔酰菌胺殺菌劑殘留量的分析方法，該方法采用QuEChERS法進行樣品溶液提取，使用分散固相萃取法進行凈化，本方法的準確度和精密度高，線性關系良好，具有簡便、快速、準確及分離效果好的優點，為雙炔酰菌胺可行性分析方法。