水產品中甲基睪酮殘留檢測方法研究進展

◎ 鄭 蓉，張 娟，姜美勤

（鈦和檢測認證集團股份有限公司，上海 200060）

食品安全與人們的身體健康密切相關。但是，在水產養殖中，為了防治各種疾病、縮短養殖周期、追求產量，存在不合理用藥、違禁使用藥物的問題，造成水產品中抗生素殘留超標，還出現了為防治水霉病而使用孔雀石綠的事件以及“3·15”曝光的海參除草劑事件等，因此中華人民共和國農業農村部對我國的食品安全問題也日益重視。

人工合成的類固醇藥物甲基睪酮（Methyltestosterone，MT），呈白色或乳白色結晶性粉末，具有雄性和蛋白同化雙重作用。在水產養殖中，苗種培育和性別控制的特效藥物之一——甲基睪酮，受到養殖戶的青睞[1]。但攝入含有甲基睪酮殘留的水產品會對人體健康產生危害，可能會造成人體激素水平失衡，肝中毒、胎體中毒等。我國國家標準中已明確規定，禁止使用甲基睪酮等激素類藥物作為動物培育的“性誘導劑”，在水產品中不得檢出甲基睪酮，因此對水產品中甲基睪酮殘留檢測方法的研究在食品安全行業中必不可少。本文概述了甲基睪酮的作用機制、危害和相關法規標準，針對水產品中甲基睪酮的前處理方法和檢測技術進行了系統綜述，并分析了未來需要解決的技術挑戰，對今后的研究進行了展望，旨在為水產品中甲基睪酮殘留檢測和監管提供技術提供參考。

1 甲基睪酮概述

1.1 甲基睪酮的機理

甲基睪酮又叫甲基睪丸素和甲睪酮，是一種蛋白同化雄性激素。在水產養殖中，甲基睪酮曾一度被用于苗種培育和性別控制，主要是為了增強受體的雄性體性、提高養殖產量等[2]。這是因為甲基睪酮可以促進線粒體的生物合成和質量控制，通過促進紅細胞生成和加強毛細血管來增加組織的凈氧輸送，使得動物體內蛋白合成和肌肉增長的速率加快，其主要通過影響魚體的性類固醇激素含量，如雌二醇、睪酮等水平進而誘導雌魚雄性化，也可通過影響硬骨魚類性別分化相關基因的表達，來達到控制性別的目的[3]。甲基睪酮的生長促進作用與生長激素的代謝升高有關。

由于甲基睪酮的特殊作用，在水產養殖過程中會存在違法使用甲基睪酮的行為。據報道，不同含量的甲基睪酮對魚類生長、代謝和發育等生理過程具有不同程度的影響。目前已有報到，甲基睪酮成功誘導了羅非魚（Oreochromis mossambicus）和虹鱒（Oncorhynchus mykiss）、點帶石斑魚（Epinephelus coioides）等多種魚類發生性逆轉，研究發現用含有 50 mg·kg-1和 100 mg·kg-117α- 甲 基 睪 酮 的 飼 料投喂出膜后15 d的大口黑鱸60 d，均獲得100%的雄 性率[4]。 研究表明，用 0 mg·kg-1、100 mg·kg-1和250 mg·kg-1濃度的甲基睪酮處理中國對蝦（Fenneropenaeus chinensis），發現不同組之間沒有顯著差異，然而在500 mg·kg-1和1 000 mg·kg-1的高劑量下，東方河對蝦生長性能顯著增強，但是性腺發育延遲，這與之前的研究一致，即快速性腺發育會對水生物種的生長性能產生負面影響[5]。穆迎春等[6]研究發現，低濃度的甲基睪酮對魚類的生長具有促進作用，而高濃度則會產生抑制作用，濃度為1～5 mg·L-1可促進金魚和鯉魚生長；濃度為10～50 mg·L-1會導致金魚或羅非魚由雌性向雄性完全逆轉；濃度為100 mg·L-1以上可使異育銀鯽變為中性不育魚。因此，甲基睪酮的使用量非常關鍵，會對水產養殖產生不同的影響。

1.2 甲基睪酮殘留的危害

甲基睪酮被作為一種性激素和強壯劑添加到飼料中時，雖然具有增加水產品產量和控制性別等優勢，但是這類激素在動物體內代謝緩慢、不易分解，當人體食用含有甲基睪酮殘留的水產品時會對自身身體健康造成巨大危害，導致肝中毒或其他重要組織器官發生生理病變，甚至具有潛在的致畸、致癌、致突變性。有研究表明，甲基睪酮代謝時間長，對人類的危害是慢性、長期和累積性的。甲基睪酮的危害主要表現在痕量殘留會干擾人體內自然激素的平衡，導致正常人生理功能紊亂，還可能造成女性消費者出現痤瘡、多毛、聲音變粗、閉經、乳腺退化和性欲改變等男性化現象，甚至對新生兒有致畸作用，干擾肝內毛細膽管的排泄功能，引起膽汁郁積性黃疸，影響兒童的正常生長發育[7]。

目前，不少國家已經禁止在水產品養殖中使用此種激素，并要求水產品中不得檢出該激素。歐盟和美國都規定在養殖中不允許使用甲基睪酮等性激素類藥物，中國在《無公害食品 水產品中漁藥殘留限量》（NY 5070—2002）中將甲基睪酮明確列為禁用藥物，中華人民共和國農業農村部發布的235號公告《動物性食品中獸藥最高殘留限量》中也規定甲基睪酮為禁用獸藥。

2 檢測樣品前處理方法

針對甲基睪酮的殘留檢測，其樣品前處理的主要步驟包括用有機試劑進行提取、溶液濃縮和凈化等。因水產品組分復雜，含有大量蛋白和脂肪，且有些成分與甲基睪酮在結構和理化性質上都相似，前處理步驟在整個檢測過程中至關重要。提取是通過化學或物理方法從物質中制取有用成分，一般是在確保待測組分的最大提取率和減少樣品基質中雜質的基礎上選擇提取方法和溶劑。優異的凈化條件能夠降低基質效應、提高方法靈敏度、保證凈化效果和回收率，因此不同基質樣品需要采用不同的凈化方法。甲基睪酮檢測常用的前處理方法有液-液萃取技術（Liquid–Liquid Extraction，LLE）、 固 相 萃 取 技 術（Soild Phase Extraction，SPE）等[8]。樣品中甲基睪酮檢測的樣品前處理方法見表1。

2.1 液-液萃取技術

LLE是利用混合物中各組分在兩種不相溶的溶劑中分配系數的不同而達到分離目的，通常采用漏斗振蕩或渦旋萃取兩種方式。激素類藥物殘留分析中常用的提取溶劑有甲醇、乙腈、丙酮、乙醚和乙酸乙酯等。基于溶劑自身特性和樣品基質來說，甲醇、乙腈和丙酮易與樣品結合，提取速度快；乙醚和乙酸乙酯適于提取脂溶性化合物[8]。乙腈是甲基睪酮殘留檢測常用的有機溶劑，可將被測組分從大量內源性物質中分離出來，具有沉淀蛋白的作用，可減少雜質對測定結果的干擾。中華人民共和國農業部發布的行業標準《水產品中甲基睪酮殘留量的測定 液相色譜法》（SC/T 3029－2006）中采用的提取方式就是用大量的石油醚和乙腈進行液液萃取，由于液液萃取操作步驟煩瑣、成本高、需要消耗大量的有機溶劑，后期的很多研究都在選取優化的萃取方式[14]。

2.2 固相萃取技術

在農藥殘留檢測中，SPE是經常會使用到的一種凈化方法，可采用不用類型的固相萃取柱凈化樣品，該方法利用目標物與吸附劑之間的作用力來保留或吸附的原理，確保達到分離效果。黃鸞玉等[10]比較 了 ODS-C18柱（200 mg/3 mL） 和 poly-sery HLB（60 mg/3 mL）對水產樣品提取液的凈化效果，結果表明C18柱回收率低于50%，HLB柱回收率可達90%，因此選擇HLB柱凈化樣品。李佩佩等[11]建立了水產品中甲基睪酮殘留的高效液相色譜的測定方法，在樣品前處理階段選擇LC-C18柱進行凈化實驗，結果表明該方法在7.0～200 μg·kg-1添加范圍內的平均回收率為82.0%～86.0%。萬譯文等[12]選擇了4種不同的固相萃取柱（C18500 mg/3 mL、HLB60 mg/3 mL、Alumina-N 60 mg/3 mL和 PCX 60 mg/3 mL）比較對甲基睪酮的凈化效果，最后選擇了Alumina-N中性氧化鋁柱（60 mg/3 mL），此固相萃取-高效液相色譜法步驟簡單，凈化效果好。

3 甲基睪酮的檢測方法

目前，國內外對水產品中甲基睪酮殘留檢測方法進行了相應的研究和報導，研究較多的主要有高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）[13]、氣相色譜-質譜聯用法（Gas Chromatography-Mass Spectrometry，GC-MS）法[14-16]、液相色譜-串聯質譜法（Liquid Chromatography Tandem mass Spectrometry，LC-MS/MS）[17-19]、酶聯免疫吸附測定法（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay，ELISA）[20]、毛細管電泳法（Capillary Electrophoresis，CE）[21]和化學發光法[22]。水產品中甲基睪酮檢測方法比較見表2。

表2 水產品中甲基睪酮檢測方法比較表

3.1 高效液相色譜法

色譜法是在甲基睪酮檢測中應用較為普遍的一種方法，其檢測的準確度和靈敏度較高，主要包括液相色譜和氣相色譜，SC/T 3029－2006就明確了使用液相色譜的方法。近些年來通過對此檢測方法應用發現，此方法樣品處理步驟繁多，檢測限較高，為10 μg·kg-1；回收率低于70%，不適合用于批量檢測，需要對其進行進一步的改良。陳培基等[23]在《水產品中甲基睪酮殘留量的測定 液相色譜法》（SC/T 3029－2006）標準的基礎上，改進了樣品前處理和色譜條件，建立了測定甲基睪酮的高效液相色譜條件。彭家杰等[24]研究優化了高效液相色譜法中的樣品轉移操作、濃縮和凈化流程、色譜條件等，使回收率和工作效率都得到了提高。黃鸞玉等[10]通過優化提取凈化方法，建立了超高效液相色譜分析方法，檢出限為5.0 μg·kg-1，提高了工作效率，減少了試劑消耗量。

3.2 色譜與質譜聯用法

色譜-質譜聯用分析法是有機物定性、定量分析的有利工具。REGAL等[25]采用液質聯用的方法（LC-MS）測定甲基睪酮的含量，發現該方法的檢測限小于5.0 μg·kg-1，有效提高了測定的靈敏度與準確度。羅柏華[26]建立了液相色譜－電噴霧串聯質譜測定的方法，該方法的定量限范圍為0.1 μg·L-1；楊霄等[27]建立了分散固相萃取-高效液相色譜-串聯質譜法測定水產品中甲基睪酮殘留量的方法，結果發現甲基睪酮在1～200 ng·mL-1線性關系良好，方法的檢出限為0.5 μg·kg-1，定量限為 1.0 μg·kg-1，用該法對羅非魚、中華鱉、凡納濱對蝦進行3個水平的加標回收試驗，回收率為82.4%～96.3%，相對標準偏差均不大于6.98%。

3.3 免疫分析學方法

免疫分析法是利用毒物與標記毒物競爭性結合抗體檢測毒物的方法，適合于復雜基質中痕量組分的分析。DAZKIEWICZ等[28]報道了測定魚飼料和豬飼料中甲基睪酮的殘留方法為直接競爭性酶聯免疫方法和膠體金免疫層析法，其檢測結果與氣相色譜-質譜分析方法結果一致，說明該法可廣泛應用于甲基睪酮的殘留檢測。LUA等[29]建立了牛尿中甲基睪酮的酶聯免疫檢測法，檢測限為266 pg·mL-1。王強等[30]建立了間接競爭酶聯免疫吸附法（ELISA）測定水產品中甲基睪酮殘留，發現該方法的抑制中濃度IC50為3.48 μg·L-1。夏武強等[31]通過膠體金標免疫層析技術（Goldimmunochromatographicas Say，GICA） 建 立了甲基睪酮快速測試方法，將待測樣品中的甲基睪酮和試紙條檢測線上包被的人工抗原甲基睪酮偶聯抗原（MT-BSA）競爭性結合金標結合墊上包被的膠體金-甲基睪酮單抗聚合物，根據檢測線呈現的紅色線條深淺來判定樣品的陰陽性，發現測試時間僅需10～15 min，試紙條的最低檢測限達到10 μg·kg-1。

3.4 其他檢測技術

除了高效液相色譜法、色譜與質譜聯用法、免疫分析學方法之外，還有毛細管電泳-紫外檢測法（檢出限1 μg·mL-1）、化學發光檢測法等其他檢測方法。

4 結語

甲基睪酮是一種人工合成的雄性激素，添加在水產品的飼料中可以提高飼料轉化率，促進蛋白質合成，提高動物生長速率。但是甲基睪酮代謝緩慢，蓄積性強，通過食物鏈進入人體會產生嚴重的副作用，因此對甲基睪酮殘留檢測就顯得尤為重要。目前國內關于高效準確檢測甲基睪酮在水產品中殘留的研究尚不完善，有待于進一步的開發和探索。對于甲基睪酮的前處理方法，相較于的行業標準SC/T 3029—2006中液-液萃取技術，現在更常用的是能減少溶劑消耗，有效降低樣品基質效應的固相萃取技術。目前對于檢測方法的研究主要有高效液相色譜法，該方法使用儀器價格適中，檢測的準確度和靈敏度較高，可滿足日常檢測的需要，但是前處理步驟復雜、耗時長、不適合批量檢測；液相色譜-串聯質譜法前處理方法簡單、能快速檢測水中激素殘留，但是儀器價格昂貴；氣相色譜-質譜法具有靈敏度高、試驗數據可靠等優點，但需要對分析物進行衍生化，結果不穩定；酶聯免疫吸附法是公認的操作簡便、快速的檢測方法，具有特異性強、靈敏、簡便、準確和樣品通量高等優點，但缺點是無法精準定性定量，只能用作初步篩查。時代發展對藥物殘留相應的配套檢測技術提出了快速、準確的要求。因此探索前處理方法簡便、自動化程度高的檢測技術用于水產品中甲基睪酮殘留檢測，將具有較為廣闊的應用前景。