布魯氏菌病微量補體結合試驗的方法改進和應用

蔣卉，馮宇，秦玉明，朱良全，范學政，丁家波*

布魯氏菌病微量補體結合試驗的方法改進和應用

蔣卉1，馮宇2，秦玉明2，朱良全2，范學政1，丁家波1*

1中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所，北京 100193；2中國獸醫藥品監察所，國家/OIE布魯氏菌病參考實驗室，北京 100081

【目的】補體結合試驗是布魯氏菌病（簡稱“布病”）血清學確診方法。現行國家標準《動物布魯氏菌病診斷技術》（GB/T 18646-2018）中收錄的補體結合試驗分為常量法補體結合試驗（CFT）和微量法補體結合試驗（mCFT），但兩者之間的相關技術參數和結果判定標準均存在差異，導致常量法CFT和mCFT檢測結果不一致。筆者通過對mCFT參數的改進優化，使現行標準中mCFT的檢測結果等效于常量法CFT，實現布病CFT的高通量準確診斷，對現有布病檢測方法進行了補充。【方法】參照布病常量法CFT反應條件和診斷標準，對現行國標中mCFT的反應時間、稀釋液、效價測定方法、結果判定等相關參數進行改進優化。改進后的mCFT方法與原mCFT方法相比，效價測定中受檢血清的稀釋度由1﹕2—1﹕64稀釋改為1﹕10稀釋，稀釋方法與常量法CFT相同，確保微量法的檢測臨界值與常量法一致；采用酶標儀讀取OD600值判定溶血強度，降低了試驗人員肉眼判定的誤差，提升了結果判定的效率和準確性；反應時間由37℃水浴30 min縮短為20 min，提高了檢測效率又不影響檢測結果；稀釋液由巴比妥緩沖液改為生理鹽水，與常量法使用相同稀釋液并可獲得理想結果。用改進的mCFT與國標的mCFT、常量法CFT分別對來自內蒙古、山東、北京、江蘇等地區的409份臨床牛、羊血清樣品（牛血清163份、羊血清246份）進行檢測，分析比較其符合率。【結果】采用改進的mCFT與常量法CFT對409份臨床樣品進行比對檢測，改進的mCFT方法檢出53份陽性、11份可疑、345份陰性；常量法CFT檢出53份陽性、9份可疑、347份陰性。比較兩者檢測結果，只有2份牛血清樣品用改進的mCFT方法檢測為可疑，而常量法CFT檢測為陰性，其余407份樣品檢測結果均一致。其中牛血清樣品的符合率98.77%，羊血清樣品的符合率100%，總符合率99.51%。而國標mCFT方法因陽性判定標準低于常量法CFT，且不設可疑區間，結果檢出97份陽性、312份陰性。與常量法CFT結果相比較，牛血清樣品的符合率88.34%，羊血清樣品的符合率89.84%，總符合率為89.24%，遠低于本研究改進的mCFT方法與常量法CFT 99.51%的符合率。【結論】通過對mCFT方法各參數的優化，建立了一種與常量法CFT判定標準一致，且檢測結果高度符合的mCFT方法。

布魯氏菌病；微量法補體結合試驗；方法改進；應用

0 引言

【研究意義】布魯氏菌病（Brucellosis，簡稱布病）是由布魯氏菌引起的一種世界性重要人畜共患病，也是最易被忽視的重要傳染病之一[1-4]。家畜感染布病后主要表現為流產、早產、不孕、瘦弱、關節腫大和產奶量減少等。人感染布魯氏菌可表現出多種熱型，同時具有多汗、乏力、頭痛與骨關節肌肉疼痛等癥狀，若不及時治療，往往難以治愈。因而，布病嚴重危害全球牛羊養殖業和人類健康[5-6]。該病屬于《中華人民共和國傳染病防治法》規定的乙類傳染病；《一、二、三類動物疫病病種名錄》（中華人民共和國農業部公告第1125號）規定的二類動物傳染病。上世紀90年代，通過疫苗免疫等防控措施，我國曾有效控制了畜間和人間布病疫情的發生。然而進入21世紀之后，隨著我國畜牧養殖業的快速發展和家畜頻繁跨區域流動，畜間和人間布病疫情出現明顯反彈，并逐年遞增。當前，布病防控形勢依然十分嚴峻，根據國家衛健委網站發布公告統計，2020年我國人間布病新增病例為47 245人，比2019年上升了7.29%。人患布病主要是因接觸患病動物或飲用被布魯氏菌污染的生乳品而感染[7-9]，準確診斷是有效防控動物布病的前提[10]。【前人研究進展】我國《動物布魯氏菌病診斷技術》（GB/T 18646-2018）國家標準（以下簡稱“布病國標”）中布病血清學診斷方法主要有虎紅平板凝集試驗（RBT）、全乳環狀反應（MRT）、試管凝集試驗（SAT）、補體結合試驗（CFT）、iELISA、cELISA[11]，其中CFT是國標和世界動物衛生組織（OIE）推薦的布病血清學確診方法[12-14]。CFT與SAT相比，具有更高的特異性；雖比ELISA操作復雜，但該方法是布病陽性血清定值的標準方法。CFT包括常量法和微量法，微量法補體結合試驗（mCFT）是在常量法CFT基礎上改進而來，與經典的常量法CFT相比，試劑用量小，操作簡便，能滿足高通量檢測需求。【本研究切入點】我國現行布病國標中已納入CFT的常量法和微量法，但是兩種方法對于同一份血清樣本的判定標準卻不一致，常量法陽性判定標準的臨界值是微量法的2.5倍，這種因標準差異導致的檢測結果差異常常給檢驗人員造成困擾。另外，通過肉眼觀察mCFT溶血抑制程度進行結果判定不僅帶有一定的主觀性，而且效率較低。【擬解決的關鍵問題】本研究通過統一mCFT與常量法CFT的判定標準，實現了檢測結果的高度符合；同時通過讀取OD600nm值代替肉眼對溶血程度的判定，提高結果讀取效率和結果判斷的準確性。并進一步采用常量法CFT、國標mCFT和本方法對內蒙古、山東、北京、江蘇地區的牛、羊血清樣品進行檢測，比較其符合率，確認改進mCFT方法的可靠性。

1 材料與方法

1.1 試驗時間和地點

本試驗于2020年12月至2021年1月在北京中國獸醫藥品監察所國家/OIE布魯氏菌病參考實驗室進行。

1.2 主要試驗材料、儀器與樣品

抗原、凍干補體由中國獸醫藥品監察所生產供應，批號分別為202001、201904。溶血素購自索萊寶生物科技有限公司，批號20180810。生理鹽水和阿氏液由國家/OIE布魯氏菌病參考實驗室參照《獸用生物制品規程》（2000 版）制備[15]。紅細胞采自公綿羊，按1﹕1（體積比）保存于阿氏液中，存放于4℃。布病陽性血清標準品購買自英國The National Institute for Biological Standards and Control （NIBSC），經CFT標定為1000 IU，批號2BADS。日立離心機，型號：HITACHI CF16RN；渦旋器，型號：Kylin-Bell VORTEX-5；全波長酶標儀，型號：Molecular Devices MAX 190，由中國獸醫藥品監察所提供。臨床樣品來源于2019—2020年分別從內蒙古、山東、北京、江蘇4個不同的省份的采集的牛、羊血清409份。

1.3 2.5%紅細胞懸液的制備

取在阿氏液中保存了7 d的綿羊紅細胞（Sheep red blood cell，SRBC），以5—10倍體積的生理鹽水離心沉淀并洗滌3次，最后一次以2 000 r/min離心10 min，棄去上清，取沉淀紅細胞，用生理鹽水配制成2.5%紅細胞懸液。

1.4 標準比色孔的配制

取500 μL 2.5%紅細胞懸液離心后去上清，加入2 mL蒸餾水，用力振搖，使紅細胞完全溶解，再加入500 μL 4.5% NaCl溶液，制成100%溶血液。再取500 μL 2.5% 紅細胞懸液，加入2 mL生理鹽水，混勻后制成100%不溶血液。取96孔U型底微孔板，按表1制成標準比色孔，使用酶標儀讀取并記錄11個標準溶血孔的OD600nm值。

表1 標準比色孔的配制

1.5 溶血素、補體和抗原效價的測定

1.5.1 溶血素效價的測定 取0.1 mL溶血素加生理鹽水4.9 mL，制成1﹕100稀釋液（因商品化溶血素均含有等量甘油作防腐劑，因此0.1 mL中實際只含有0.05mL標定效價的溶血素）。再取1﹕100稀釋液1 mL加生理鹽水4 mL，制成1﹕500基礎稀釋液。取1﹕500基礎稀釋液按下表2制成不同稀釋度溶血素。取1瓶凍干補體，用生理鹽水配制1﹕10稀釋液。取96孔U型底微孔板，按表3依次加入不同稀釋度溶血素、2.5%紅細胞、1﹕10稀釋補體、生理鹽水，使總量為125 μL。振蕩混勻后置37℃水浴作用20 min，取出后立即用酶標儀讀取并記錄各孔的OD600nm值，并參照標準溶血孔的OD600nm值判定結果。

1.5.2 補體效價的測定 以生理鹽水配制1﹕10補體基礎稀釋液（如補體活力高可配制1﹕20基礎稀釋液）和一個工作量的抗原稀釋液。取96孔U型底微孔板，按表4依次加入補體稀釋液、抗原、生理鹽水于A行各孔，B行不加抗原用生理鹽水補充，其余成分與A行相同。振蕩混勻后置37℃水浴作用20 min。取出后每孔加入2.5%紅細胞和2個單位溶血素各25 μL，振蕩混勻后再置37℃水浴作用20 min，取出后立即用酶標儀讀取并記錄各孔的OD600nm值，并參照標準溶血孔的OD600nm值判定結果。

表2 溶血素的稀釋

表3 溶血素效價的測定

表4 補體效價的測定

1.5.3 抗原效價的測定 商品化抗原可按說明書稀釋到工作量使用。如要測定效價，可用生理鹽水將抗原原液制成1﹕10、1﹕50、1﹕75、1﹕100、1﹕150、1﹕200、1﹕250、1﹕300、1﹕400和1﹕500稀釋液。用生理鹽水將布病陽性血清標準品制成1﹕120、1﹕160、1﹕200、1﹕240、1﹕280稀釋液，將布病陰性血清制成1﹕10稀釋液。稀釋后的陰、陽性血清56℃水浴滅能30 min。取96孔U型底微孔板，按表5依次加入稀釋抗原、稀釋血清、工作補體、生理鹽水，振蕩混勻后置37℃水浴作用20 min。取出后每孔加入2.5%紅細胞和2個單位溶血素各25 μL，振蕩混勻后再置37℃水浴作用20 min，取出后立即用酶標儀讀取并記錄各孔的OD600nm值，并參照標準溶血孔的OD600nm值判定結果。

1.6 臨床樣品的檢測

1.6.1 改進的mCFT檢測 通過上述溶血素、補體、抗原最佳濃度的測定后，將臨床血清409份（其中牛血清163份、羊血清246份）、陽性對照血清和陰性對照血清在96孔深孔稀釋板中用生理鹽水作1﹕10倍稀釋，放入水浴鍋中滅能，牛血清樣品用56℃滅能30 min，羊血清樣品用58℃滅能30 min。然后取96孔U型底微孔板按表6進行臨床樣品的檢測，用酶標儀讀取并記錄各孔的OD600nm值并判定結果。陽性血清加抗原對照孔和溶血素對照孔，須完全抑制溶血；陽性血清不加抗原對照孔和其他對照孔完全溶血，試驗成立。被檢臨床血清不加抗原對照孔應完全溶血，表明反應結果符合要求，可判定被檢臨床血清加抗原檢測孔結果，對照表1標準比色孔OD600nm值判定結果。100%溶血判定為陰性；50%—90%溶血判為可疑；0%—40%溶血判為陽性。

表5 抗原效價的測定

1.6.2 國標mCFT和常量法CFT檢測 按照國家標準《動物布魯氏菌病診斷技術》（GB/T 18646-2018）[9]對409份臨床血清樣品分別進行mCFT和常量法CFT檢測，將1.6.1中改進mCFT、1.6.2中國標mCFT的檢測結果分別與常量法CFT進行符合率比較。

表6 臨床樣品的檢測

2 結果

2.1 溶血素效價測定

在過量補體的存在下，能使25 μL的2.5%紅細胞完全溶血的溶血素最高稀釋度，即為溶血素效價。本試驗測得溶血素效價為1﹕3 000，進行正式試驗時，溶血素的使用濃度比其效價大一倍（即2個單位），為1﹕1 500。

2.2 補體效價測定

在2個單位溶血素的存在下，能使25 μL的2.5%紅細胞完全溶血的補體最小使用量，即為補體效價。按公式計算，原補體稀釋倍數=補體稀釋倍數/稀釋后補體加入量×正式試驗時每管需要加入的工作補體量。本試驗測得第5孔為能使25 μL的2.5%紅細胞完全溶血的補體最小使用量，對照表4即使用的補體稀釋倍數為10，稀釋后補體加入量為11，正式試驗時每管需要加入的工作補體量為25，因此原補體稀釋倍數為10/11×25≈22.7，補體應作1﹕22.7倍使用。考慮到補體的不穩定性，正式試驗時工作補體濃度應比補體效價大10%，即本試驗工作補體濃度為1﹕20。

2.3 抗原效價的測定

對布病陽性血清標準品各稀釋度均發生最強抑制溶血的抗原最高稀釋度，即為抗原的效價。本試驗測得抗原在1﹕150倍稀釋時與布病陽性血清標準品各稀釋度均能發生最強抑制溶血反應，因此抗原效價為1﹕150。實際使用時應比測得的效價提高25%的濃度使用，即本試驗工作抗原濃度為1﹕112.5。

2.4 臨床樣品的檢測

在2.1、2.2和2.3結果的基礎上，按照表6的操作方法對來自北京（牛血清94份）、山東（牛血清69份）、內蒙古（羊血清140份）和江蘇（羊血清106份）的409份臨床血清樣品進行檢測。結果陽性血清加抗原對照孔和溶血素對照孔須完全抑制溶血，陽性血清不加抗原對照孔和其他對照孔完全溶血，試驗成立。被檢臨床血清不加抗原對照孔完全溶血，表明反應結果符合要求。根據判定標準，讀取被檢臨床血清加抗原檢測孔的OD600nm值，對照表1標準比色孔OD600nm值判定結果。409份臨床牛、羊血清中53份陽性、11份可疑、345份陰性。另外按照國家標準《動物布魯氏菌病診斷技術》（GB/T 18646-2018）[9]對上述409份樣品進行國標mCFT和常量法CFT平行檢測。結果常量法CFT檢出53份陽性、9份可疑、347份陰性，與本研究改進的mCFT檢測結果相比較，只有2份牛血清樣品用改進的mCFT方法檢測為可疑，而常量法CFT檢測為陰性，其余407份樣品檢測結果均一致。牛血清樣品的符合率98.77%，羊血清樣品的符合率100%，總符合率99.51%。而國標mCFT方法因陽性判定標準低于常量法CFT，且不設可疑區間，結果檢出97份陽性、312份陰性，與常量法CFT相比較，牛血清樣品的符合率88.34%，羊血清樣品的符合率89.84%，總符合率為89.24%。具體結果見表7。

表7 臨床樣品布魯氏菌病補體結合試驗檢測結果

3 討論

3.1 現行國標中CFT常量法與微量法的結果制定存在差異

補體結合試驗是一種經典的抗原、抗體檢測方法，可用于診斷各種傳染病，是免疫學上一個應用較廣泛的重要試驗[16-17]。在布病的血清學診斷方法中，相較于其他方法，CFT具有更高的特異性[18-20]，是國際公認的確診方法之一[21-23]，但是該方法操作復雜，實驗體系包括溶血素、紅細胞、補體、血清、抗原、生理鹽水等多種成分[24-25]，除生理鹽水以外，其余5種成分相互間存在著嚴格的量值關系[26]。因此該試驗對操作人員的要求較高，且用時長，未能在基層實驗室得到廣泛應用[27-28]。盡管如此，CFT方法作為布病陽性血清定值的標準方法[13, 29]，是用于國際間布病實驗室能力比對的重要方法之一，在布病血清學診斷中具有不可替代性。

我國布病診斷國標中CFT包括常量法和微量法兩種。常量法試劑使用量較大，擺放和標記試管費時費力，不適合大量樣本的檢測。微量法相對于常量法更容易操作，適用于大量樣本的檢測。目前布病診斷國標中采用的微量法與常量法對陰陽性結果的判定標準存在較大差異，比如在常量法中，對布病陽性的判定值≥50 IU·mL-1；而在微量法中，布病陽性的判定值為≥20 IU·mL-1。因此，當某一份血清其布病抗體效價介于20—50 IU·mL-1時，微量法檢測為陽性，而常量法則判為陰性或可疑。因此，統一微量法與常量法的判定標準十分必要。另外，由于微量法在判定溶血抑制程度時是通過肉眼比較各反應孔與溶血標準比色孔之間的接近程度進行的，主觀性強，而且費時費力，誤差較大。

3.2 改進后的微量法CFT與常量法判定標準一致

針對布病診斷國標中mCFT存在的突出問題，本研究參照常量法CFT的反應條件和判定標準，從反應時間、稀釋液、效價測定方法、結果判定等各方面對國標mCFT進行了改進，改進后的方法既提升了mCFT的檢測效率，又能達到了常量法的準確性。為了克服檢驗人員對96孔U型底微孔板溶血程度判定的誤差，本研究采用了酶標儀讀取溶血強度；反應時間由37℃水浴30 min縮減為20 min，與常量法CFT反應時間一致，既提高的檢測效率又不影響檢測結果；稀釋液由巴比妥緩沖液改為生理鹽水，主要是巴比妥類試劑為中樞神經系統的鎮靜劑，可用于鎮靜與麻醉，難以購買獲得，而與常量法CFT一樣使用生理鹽水作為稀釋液亦可獲得滿意的結果；效價測定中受檢血清的稀釋度由1﹕2—1﹕64稀釋改為1﹕10稀釋，稀釋方法與常量法CFT一致，確保了微量法與常量法判定標準一致。在此基礎上，我們用改進的mCFT方法與常量法同時對409份臨床牛、羊血清樣品進行檢測，結果符合率99.51%，高于國標中mCFT與常量法89.24%的符合率。

需要注意的是補體結合試驗各成分之間量的關系起始于紅細胞，以紅細胞作為基礎尺度，才能規定溶血素和補體的用量[30]。有了補體的用量，衡量受檢血清的陰、陽性才有了標準。如果紅細胞的用量改變了，則規定出來的補體用量和陰、陽性標準也就改變了。因此每次試驗操作中紅細胞的濃度和用量必須準確，新配制的紅細胞懸液應重新配置標準溶血孔并讀取OD600nm值，重新滴定溶血素和補體的效價，才能使每次試驗得到相同的結果，確保試驗結果的準確性和可重復性。

4 結論

通過對微量法補體結合試驗（mCFT）各參數的優化，建立了一種與常量法補體結合試驗（CFT）判定標準一致，且檢測結果高度符合的mCFT方法，特別是通過酶標儀讀數代替肉眼觀察，保證了檢測結果的準確性，同時縮短了檢測時間。與常量法CFT相比較，操作步驟相對簡單，適用于實驗室大量樣本的檢測，更易在基層實驗室推廣應用。在國家/OIE布病參考實驗室大量臨床樣本的檢測中，該方法與布病間接ELISA方法的聯合使用，提高了檢測結果的準確性，是對現有布病診斷方法的完善與補充。

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Method Improvement and Its Application of Micro Complement Fixation Test for Brucellosis

JIANG Hui1, FENG Yu2, QIN YuMing2, ZHU LiangQuan2, Fan XueZheng1, DING JiaBo1*

1Institute of Animal Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193;2National/OIE Reference Laboratory for Brucellosis, China Institute of Veterinary Drug Control, Beijing 100081

【Objective】 The complement fixation test is used as a confirmatory test for the serodiagnosis of brucellosis.The complement fixation tests are divided into constant complement fixation test (CFT) and micro complement fixation test (mCFT) in diagnostic techniques for animal brucellosis (GB/T 18646-2018).However, there are differences in the related technical parameters and judgment of the result between them, which lead to the inconsistency of CFT and mCFT results.In this study, By the improvement and optimization of the parameters of mCFT, this study made the detection results ofmCFT equivalent to classicalCFT, and achieved the high-throughput and accurate diagnosis of CFT for brucellosis.【Method】 According to classical CFT reaction conditions and diagnostic criteria, the reaction time, diluent, titer determination, result judgment and other related parameters for the current national standard of mCFT were optimized and improved.Compared with the original method, the dilution of the tested serum was changed from 1:2-1:64 to 1:10.The dilution method was the same as classical CFTso that the detection critical value was consistent with the constant method.The OD600value was read by the microplate reader to determine the hemolysis intensity, which reduced the error caused by visual judgmentandimproved the efficiency and accuracy of result judgment.The reaction time was shortened from 30 min to 20 min in water bath at 37℃, which improved the detection efficiency without affecting the results.The diluent was changed from barbital buffer to normal saline, which used the same diluent of classical CFT andachievedsatisfactory results.The 409 clinical bovine and sheep serum samples (163 bovine serum samples and 246 sheep serum samples) from Inner Mongolia, Shandong, Beijing and Jiangsu were detected by improved mCFT, the national standard mCFT,and classical CFT, respectively.The coincidence rate was analyzed and compared.【Result】By detecting the 409 clinical samples, the result showed that 53 samples were positive, 11 sampleswere suspicious and 345 were negative by improved mCFT.The 53 positivesamples, 9 suspicioussamples and 347 negative samples were detected by classical CFT.Compared with the results of the two methods, only two bovine serum samples were suspicious by the improved mCFT, which were negative by classical CFT.The results of the other 407 samples were consistent.The coincidence rate of bovine serum samples was 98.77%, which of sheep serum samples was 100%, and the total coincidence rate was 99.51% between improved mCFT and classical CFT.However, the positive criteria of national standard mCFT were lower than that of classical CFT, and no suspicious interval was set.The results showed that 97 samples were positive and 312 samples were negative.Compared with the results of classical CFT, the coincidence rate of bovine serum samples was 88.34%, which of sheep serum samples was 89.84%; the total coincidence rate was 89.24%, which was far lower than 99.51% of improved mCFT and classical CFT.【Conclusion】 By optimizing the parameters of mCFT, the mCFT method was established, which was highly consistent with the criterion and the results of the classical CFT.

brucellosis; micro complement fixation test; method improvement; application

2021-04-12；

2021-05-31

國家重點研發計劃（2016YFD0500902）

蔣卉，E-mail：15011216921@163.com。通信作者丁家波，Tel：010-61255327；E-mail：dingjiabo@126.com

（責任編輯 林鑒非）