circ-13267通過let-7-19/ERBB4通路調控蛋鴨卵泡顆粒細胞凋亡

吳艷，張昊，梁振華，潘愛鑾，申杰，蒲躍進，黃濤，皮勁松*，杜金平

circ-13267通過let-7-19/ERBB4通路調控蛋鴨卵泡顆粒細胞凋亡

吳艷1,2，張昊1，梁振華1，潘愛鑾1，申杰1，蒲躍進1，黃濤1，皮勁松1*，杜金平1

1湖北省農業科學院畜牧獸醫研究所/湖北省農業科技創新中心，武漢 430064；2動物胚胎工程及分子育種湖北省重點實驗室，武漢 430064

【背景】蛋鴨卵泡發育是決定其產蛋性能的關鍵因素。已有研究表明，禽類卵泡發育是極為復雜的生物學過程，目前人們已對家禽的卵泡發育模式有了一定的了解，但作為決定產蛋量的重要因素，卵泡發育的具體調控機理仍需進一步深入研究。顆粒細胞是卵泡中主要的功能細胞，可調控卵泡膜細胞和卵母細胞的生長、分化和成熟，同時也精確的調控卵泡的生長發育，維持卵巢的正常功能（誘導排卵、維持成熟分裂的阻斷、為卵母細胞提供底物等）。circRNA是一類新型的內源性非編碼RNA，在卵泡發育中發揮重要的調控作用。【目的】通過構建circRNA過表達載體上調circ-13267的表達，研究circ-13267在蛋鴨卵泡顆粒細胞中的作用及其調控機制，為蛋鴨卵泡發育的調控機制解析提供依據。【方法】首先，利用Q-PCR檢測蛋鴨卵泡顆粒細胞的細胞質與細胞核中circ-13267的表達水平；構建circ-13267的過表達載體circ-13267-pLCDH，在蛋鴨顆粒細胞中過表達circ-13267后，利用Q-PCR法檢測circ-13267、let-7-19、ERBB4、FAS和BCL2的表達水平；分別轉染circ-13267-pLCDH和pLCDH-ciR于蛋鴨卵泡顆粒細胞，24 h后利用EdU法檢測蛋鴨卵泡顆粒細胞的增殖能力；將circ-13267的線性序列或ERBB4的3′UTR克隆到pmirGLo載體中，同時對上述野生型序列中的let-7-19結合位點進行突變，得到表達突變型序列的載體，利用雙熒光素酶報告基因驗證circ-13267與let-7-19及let-7-19與靶基因ERBB4的結合關系；在蛋鴨卵泡顆粒細胞中轉染circ-13267-pLCDH和pLCDH-ciR，利用流式細胞術和Annexin V-FITC檢測蛋鴨卵泡顆粒細胞凋亡情況。【結果】環狀RNA circ-13267在細胞質和細胞核中均有表達；雙熒光素酶報告基因試驗結果顯示，let-7-19能與ERBB4結合，進而下調熒光素酶的活性，當ERBB4序列中let-7-19的結合位點突變后，let-7-19則無法抑制熒光素酶的表達，說明ERBB4是let-7-19的一個靶基因；熒光定量檢測結果顯示，過表達環狀RNAcirc-13267后BCL2基因的表達顯著降低（＜0.05），而FAS和ERBB4基因的表達量顯著升高（＜0.05），當過表達let-7-19后，ERBB4基因的表達量顯著升高（＜0.05），而抑制let-7-19后ERBB4基因的表達量顯著降低（＜0.05）；EdU試驗結果顯示，過表達circ-13267后蛋鴨卵泡顆粒細胞數量顯著減少，說明其促進了蛋鴨卵泡顆粒細胞的凋亡；然而，在蛋鴨卵泡顆粒細胞中共轉染circ-13267和let-7-19后，與對照組相比共轉染組中BCL2和FAS的表達量均無顯著變化（＞0.05），而與過表達circ-13267組相比，共轉組中BCL2基因的表達量極顯著降低（＜0.01）、FAS的表達量極顯著升高（＜0.01），說明circ-13267促進蛋鴨卵泡顆粒細胞凋亡的作用被抑制；利用流式細胞儀檢測轉染后的蛋鴨卵泡顆粒細胞發現，與共轉染circ-13267和let-7-19組相比，僅過表達circ-13267后，晚期凋亡細胞數和總凋亡細胞數均顯著增加（＜0.05），而活細胞數顯著降低（＜0.05）。【結論】蛋鴨circ-13267在蛋鴨卵泡顆粒細胞的細胞質和細胞核中均有表達，circ-13267可以吸附let-7-19并靶向ERBB4基因，從而促進了蛋鴨卵泡顆粒細胞的凋亡，為解析蛋鴨卵泡發育的調控機制提供理論依據。

circRNA；miRNA；蛋鴨；卵泡發育；顆粒細胞

0 引言

【研究意義】蛋鴨卵泡發育是決定其產蛋性能的關鍵因素。已有研究表明，禽類卵泡發育是極為復雜的生物學過程，目前人們已對家禽的卵泡發育模式有了一定的了解，但作為決定產蛋量的重要因素，卵泡發育的具體調控機理仍需進一步深入研究。【前人研究進展】Circular RNA（circRNA）是一類新型的內源性非編碼RNA，它是在mRNA前體剪切過程中通過首尾相連形成的共價閉合環狀結構，其形成主要依賴于經典的剪接性位點和剪接性機制[1-3]，受特定順式作用元件和反式作用因子調節[4-5]，穩定性顯著高于線性RNA，可通過海綿吸附微小RNA (microRNA，miRNA) 或其他分子，在轉錄和轉錄后水平發生調控作用[6-7]。已有研究表明，circRNA在卵泡發育過程和子宮內膜細胞中發揮重要的調控作用，如ZHANG等[8]研究發現circRNA在卵巢激素生成等過程中發揮作用；JIA等[9]研究發現CircEGFR可能通過與miR-125a-3p競爭性結合調節Fyn，從而在小鼠卵巢GCs中發揮重要作用；TAO等[10]研究發現circNRA在山羊排卵前卵泡顆粒細胞中發揮重要作用；ZHANG等[11-12]在奶山羊中發現circRNA-9119通過吸附miR-26a調控奶山羊子宮內膜上皮細胞PTGS2基因的表達，circRNA-miR182通過調控睪丸素抑制了山羊受孕前期子宮內膜上皮細胞凋亡。XU等[13]鑒定獲得了卵巢中與豬產仔數相關的circRNA。有關circRNA在家禽卵泡發育中的研究相對較少，僅見SHEN等[14]分析了雞卵泡顆粒細胞circRNA 的動態表達及功能；ZHANG等[15]研究發現circRNA通過PPAR和脂肪酸代謝相關途徑調節miRNAs，從而潛在地影響脂肪的形成。【本研究切入點】關于蛋鴨circRNA在卵泡發育中的研究僅見本團隊前期研究報道，其中circ-13267在白卵泡和黃卵泡組織中表達量存在顯著差異[16]。顆粒細胞是卵泡中主要的功能細胞，其可調控卵泡膜細胞和卵母細胞的生長、分化和成熟，同時也精確的調控卵泡的生長發育[17]，維持卵巢的正常功能（誘導排卵、維持成熟分裂的阻斷、為卵母細胞提供底物等）[18]。【擬解決的關鍵問題】本研究擬通過構建circRNA過表達載體上調circ-13267的表達，研究circ-13267調控蛋鴨卵泡顆粒細胞的機制，為蛋鴨卵泡發育的調控提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

蛋鴨卵泡顆粒細胞：采集湖北農業科學院畜牧獸醫研究所家禽試驗場選育的蛋鴨卵泡組織，迅速置于含有2%雙抗（青霉素和鏈霉素）的PBS中，盡快返回實驗室，并分離卵泡顆粒細胞。

主要試劑：DMEM 基礎培養基、含EDTA 的胰酶稀釋液、PBS 緩沖液、胎牛血清、青霉素和鏈霉素購自Hyclone（美國）；Lipofectamine? 3000 轉染試劑盒、Opti-MEM?試劑購自Invitrogen（美國）；雙熒光素酶檢測試劑盒購自Promega公司；SYBR Green qPCR Mix 購自Thermo（美國）；HⅠ、RⅠ限制性內切酶和T4 DNA連接酶購自Thermo公司；KOD FX酶購自TOYOBO，公司；凝膠DNA小量回收試劑盒和無內毒素質粒抽提試劑盒購自OMEGA公司（美國）；PrimeScriptTMRT reagent Kit反轉錄試劑盒購自寶生物工程（大連）有限公司；熒光定量PCR酶購自BIO-RAD公司；環狀RNA過表達載體PLCDH-ciR，購自吉賽生物科技有限公司；其余有機試劑均為國產分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 蛋鴨卵泡顆粒細胞分離培養與轉染 選擇產蛋期蛋鴨頸靜脈放血處死后取整個卵巢組織，置于裝有預冷PBS的無菌培養皿中迅速帶回實驗室，用加有雙抗的PBS 清洗數次。將漂洗干凈的卵泡移入裝有預冷PBS緩沖液的平皿中，剝凈卵泡外膜、結締組織及血管網，劃破卵泡后釋放卵黃，將漂洗干凈的卵泡膜盡量剪碎，置于15 mL離心管中，加4 mL培養基反復吹打1 min，4 ℃ 1 000 r/min離心后棄上清；加入4 mL 0.2%Ⅱ型膠原酶，重懸沉淀，置于37℃恒溫搖床80 r/min消化30 min，加入4 mL M199完全培養基（含10%血清）終止消化；用200目不銹鋼篩過濾，收集濾液，4℃ 1 000 r/min離心10 min后收集細胞，加入M199完全培養基（含10% FBS及1 %雙抗）重懸后，測定細胞密度后接種于6孔培養皿，置于37℃、5 % CO2培養箱內靜置培養，培養24 h后可用后續相關試驗。使用轉染試劑lip 3000按照轉染說明書對細胞進行轉染，轉染24 h后收獲細胞。

1.2.2 蛋鴨卵泡顆粒細胞核質分離與RNA提取 根據PARIS? Kit（Invitrogen，ThermoFisher Scientific）試劑盒說明書進行蛋鴨卵泡顆粒細胞并提取細胞中的總RNA。

1.2.3 載體構建 環狀RNA過表達載體pLCDH-ciR購自廣州吉賽生物技術有限公司。根據環狀RNA測序分析獲得的circ-13267基因序列，設計并合成circ-13267的全長序列引物（表1）。擴增circ-13267序列全長，切膠回收后，用RI和HI于37 ℃雙酶切PCR產物和pLCDH-ciR空載體。酶切后回收目的片段和空載體，利用T4連接酶將目的片段與pLCDH-ciR載體連接，將其命名為circ-13267-pLCDH。

1.2.4 RNA反轉錄與實時熒光定量PCR 使用TRIzol提取細胞和組織總RNA，利用RNase R處理RNA后按照TaKaRa反轉錄試劑盒說明書進行cDNA的合成，qPCR使用Bio-Rad公司的實時熒光定量PCR儀完成。circ-13267、β-actin、let-7-19、U6及ERBB4基因的定量引物見表1。反應條件為: 95 ℃預變性10 min；95℃10 s，60℃ 30 s，72℃30s，重復40個循環，用2–ΔΔCt法計算基因表達。

表1 試驗所需引物序列

1.2.5 circRNA與miRNA及靶基因結合位點的預測 利用在線預測軟件BiBiServ中的rnahybrid 進行circ-13267與miRNA let-7-19及let-7-19與靶基因ERBB4之間的結合位點，詳細預測網址如下：https://bibiserv.cebitec.uni-bielefeld.de/rnahybrid。

1.2.6 雙熒光素酶報告實驗檢測熒光素酶活性 將circ-13267的線性序列或ERBB4的3′UTR克隆到pmirGLo載體中，同時對上述野生型序列中的let-7-19結合位點進行突變，得到表達突變型序列的載體，分別命名為circ-13267-pmirGLO-W、circ-13267-pmirGLO- M、pmirGLo- ERBB4-W和pmirGLo- ERBB4-M。將上述載體分別與let-7-19模擬物共轉染蛋鴨卵泡顆粒細胞，按照熒光素酶活性檢測試劑盒說明書進行，測定螢火蟲熒光素酶（firefly luciferase，FL）和海腎熒光素酶（ranilla luciferase，RL）強度，根據FL/RL比值來判斷相對熒光素酶活性。

1.2.7 EdU試驗檢測細胞增殖能力 將分離的蛋鴨卵泡顆粒細胞接種到24孔板, 使細胞匯合度達到80%，分別轉染circ-13267-pLCDH和pLCDH-ciR于蛋鴨卵泡顆粒細胞，24 h后進行EdU處理。每孔加300 μL稀釋EdU溶液孵育2 h。然后按照EdU試劑盒說明書（廣東銳博）進行細胞固定、Apollo染色和DNA染色。最后在熒光顯微鏡下（Olympus SZX16）拍照。

1.2.8 顆粒細胞凋亡檢測 參照杭州聯科生物技術股份有限公司的Annexin V-FITC/PI 雙染細胞凋亡檢測試劑盒說明書進行蛋鴨顆粒細胞凋亡檢測。取細胞接種于6 孔板，當細胞匯合度達到80%左右，轉染circ-13267-pLCDH和pLCDH-ciR于顆粒細胞，培養24 h后消化并收集細胞。然后按照Annexin V-FITC/PI試劑盒說明書進行細胞處理，最后用流式細胞儀檢測分析（每個試驗組設3個重復）。

1.2.9 數據統計分析 每個試驗設3個重復，采用SPSS 19.0進行結果統計分析，兩組樣本均數比較采用t檢驗，利用GraphPad Prism 6進行作圖。

2 結果

2.1 circ-13267對蛋鴨卵泡顆粒細胞增殖、凋亡的影響

轉染circ-13267- pLCDH和pLCDH-ciR后的蛋鴨卵泡顆粒細胞后，利用熒光定量PCR法檢測細胞增殖凋亡關鍵基因BCL2、FAS的表達情況，結果見圖1-a，由圖1-a可以看出，過表達circ-13267后細胞增殖標志基因BCL2的表達量極顯著降低（＜0.01），細胞凋亡標志基因FAS的表達量顯著升高（＜0.01），說明circ-13267促進了蛋鴨卵泡顆粒細胞的凋亡；EdU法檢測細胞凋亡情況，結果表明過表達circ-13267后，蛋鴨卵泡顆粒細胞數量顯著減少（圖1-b）。

A：過表達circ-13267后熒光定量檢測；B：過表達circ-13267后EdU檢測

2.2 circ-13267抑制let-7-19在蛋鴨顆粒細胞中的表達

為探討circ-13267在蛋鴨卵泡顆粒細胞中的功能，分別提取細胞質和細胞核中的RNA進行逆轉錄，熒光定量PCR檢測circ-13267的表達情況，結果表明circ-13267在細胞質和細胞核中均有表達（圖2），說明circ-13267可能具備競爭性結合miRNA的作用。分析circ-13267中miRNA的結合位點，結果發現circ-13267中存在let-7-19的結合位點（圖3），并在前期研究中得到證明[16]。熒光定量檢測結果發現let-7-19在白卵泡中的表達顯著高于黃卵泡（＜0.05）（圖4）。

圖2 circ-13267在細胞質與細胞核中的表達量

圖3 circ-13267與let-7-19的結合位點

2.3 circ-13267通過let-7-19上調ERBB4基因表達

分析let-7-19的下游靶基因，發現let-7-19在ERBB4基因3′UTR區域存在結合位點（圖5-a）。利用雙熒光素酶報告基因s試驗表明，let-7-19能與ERBB4結合，進而下調熒光素酶的活性，當ERBB4序列中let-7-19的結合位點突變后，let-7-19則無法抑制熒光素酶的表達（圖5-b）。熒光定量結果顯示，ERBB4基因在白卵泡中的表達顯著低于黃卵泡（＜0.05）（圖5-c）；當過表達let-7-19后，ERBB4基因的表達量顯著升高（＜0.05），而抑制let-7-19后ERBB4基因的表達量顯著降低（＜0.05）（圖5-d）。綜上可知，circ-13267可通過let-7-19上調ERBB4基因的表達。

** P＜0.01

A：let-7-19在ERBB4基因3′非編碼區（3′ untranslated region，3′UTR）中的結合位點；B：雙熒光素酶報告基因實驗檢測let-7-19與ERBB4的結合能力；C：ERBB4在黃卵泡和白卵泡中的表達情況；D：過表達（抑制表達）let-7-19后ERBB4的表達變化情況。* P＜0.05; ** P＜0.01

2.4 circ-13267通過let-7-19/ERBB4途徑促進蛋鴨卵泡顆粒細胞的凋亡

進一步探討circ-13267是否通過let-7-19/ERBB4通路在蛋鴨卵泡顆粒細胞中發揮作用。在蛋鴨卵泡顆粒細胞中共轉染circ-13267和let-7-19后，與對照組相比共轉染組中BCL2和FAS的表達量均無顯著變化（＞0.05），而與過表達circ-13267組相比，共轉組中BCL2基因的表達量極顯著降低（＜0.01）、FAS的表達量極顯著升高（＜0.01）（圖6-a），circ-13267促進蛋鴨卵泡顆粒細胞凋亡的作用被抑制；利用流式細胞儀檢測轉染后的蛋鴨卵泡顆粒細胞發現，與共轉染circ-13267和let-7-19組相比，僅過表達circ-13267后，晚期凋亡細胞數和總凋亡細胞數均顯著增加（＜0.05），而活細胞數顯著降低（＜0.05）（圖6-b）。此外，熒光定量結果表明，過表達circ-13267后，ERBB4基因的表達量顯著升高（＜0.05），而同時過表達circ-13267和let-7-19后，ERBB4基因的表達量無顯著變化（＞0.05）（圖6-C）。綜上，說明circ-13267通過let-7-19/ERBB4途徑促進了蛋鴨卵泡顆粒細胞的凋亡。

A：過表達circ-13267及let-7-19對顆粒細胞增殖凋亡的Q-PCR檢測；B：過表達circ-13267及let-7-19對顆粒細胞增殖凋亡的流式細胞檢測；C：過表達circ-13267和let-7-19后ERBB4基因表達變化情況

3 討論

卵巢中卵泡的發育對蛋鴨的產蛋量具有直接影響，但作為決定產蛋量的重要因素，蛋鴨卵泡發育受多種因素的影響、調控機制復雜。因此，探討明確蛋鴨卵泡發育的具體調控機制具有重要的實踐意義。

家禽的卵泡發育按照其直徑的大小分為等級前卵泡（包括小白卵泡、大白卵泡和小黃卵泡）和等級卵泡（又稱為排卵前卵泡）[19-20]。雞卵泡發育的現有理論認為，每當一次排卵活動發生后，就會有一個等級前卵泡進入卵泡選擇，即有一個小黃卵泡被選擇進入等級發育階段[21-22]。由此可見，小黃卵泡的發育是決定等級卵泡的關鍵。前期研究發現circ-13267在白卵泡組織中的表達量顯著高于小黃卵泡組織[16]，提示circ-13267可能在蛋鴨的卵泡發育過程中發揮重要的作用。顆粒細胞的發育早于卵母細胞的發育[23]，由此可見顆粒細胞的生長分化是原始卵泡生長的關鍵因素，而顆粒細胞的凋亡是卵泡閉鎖的主要標志[24]，因此本研究以蛋鴨卵泡顆粒細胞作為研究卵泡發育的細胞模型。本研究發現，過表達circ-13267后促進了蛋鴨卵泡顆粒細胞凋亡，而已有研究表明顆粒細胞的凋亡會導致生長卵泡和排卵前卵泡的閉鎖[25]，因此推測circ-13267對蛋鴨卵泡發育具有一定的抑制作用。

已有研究表明，circRNAs通常通過吸附miRNA從而調控下游靶基因的表達，且在雞的卵泡發育中發揮重要的作用[14]。已有研究表明ERBB4基因是表皮生長因子受體（EGFR）家族的成員之一，與EGFR基因具有高度的同源性[26]；調節細胞的增殖、遷移和存活等過程[27]。WU等[28]研究表明EGFR對鵪鶉卵泡顆粒細胞的增值具有促進作用，因此推測ERBB4基因與卵泡發育相關。且VEIKKOLAINEN等[29]最新研究發現ERBB4的確在卵泡發生過程中起著重要作用。此外，有多項研究表明ERBB4基因表達受到多個miRNA的調控，包括miR146a[30]、miR-551b[31]、miR-302b[32]和miR-193a-3p[33]。已有研究表明miRNA let-7家族let-7家族的miRNAs在多種癌癥中都有很好的抑癌作用[34-36]；過表達let-7 miRNAs后在某些白血病環境中抑制增殖和促進分化[37]；let-7家族在視網膜和玻璃體發育過程中具有重要作用，可能會調節透明質酸的含量[38]；SPINT1-AS1通過調控miR-let-7a/b/ i-5p促進乳腺癌細胞增殖和遷移[39]；let-7b抑制t(8;21) AML細胞系的增殖[40]。綜上所述，miRNA let-7家族在細胞凋亡中具有重要的作用。本研究結果表明，circ-13267和靶基因ERBB4的3′UTR中均存在miRNA let-7-19的結合位點，且circ-13267可通過吸附let-7-19上調ERBB4基因的表達；且circ-13267通過let-7-19/ERBB4途徑促進了蛋鴨卵泡顆粒細胞的凋亡，但circ-13267調控蛋鴨卵泡發育的是否還通過其他途徑發揮作用尚需進一步研究證實。

4 結論

對前期篩選獲得的環狀RNA circ-13267的功能及其調控蛋鴨卵泡發育的機制進行研究，構建了circ- 13267-miRNA調控網絡，初步證實circ-13267可通過let-7-19/ERBB4途徑促進蛋鴨卵泡顆粒細胞的凋亡，對蛋鴨卵泡發育的調控機制研究具有借鑒作用。

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circ-13267 Regulates Egg Duck Granulosa Cells Apoptosis Through Let-7-19/ERBB4 Pathway

WU Yan1,2, ZHANG Hao1, LIANG ZhenHua1, PAN AiLuan1, SHEN Jie1, PU YueJin1, Huang Tao1, PI JinSong1*, DU JinPing1

1Institute of Animal Husbandry and Vetervinary, Hubei Academy of Agricultural Science; Hubei Innovation Center of Agricultural Science and Technology, Wuhan 430064;2Hubei Key Lab of Animal Embryo Technology and Molecular Breeding, Wuhan 430064

【Background】 Follicle development is a key factor for laying performance of egg ducks.Previous studies have shown that follicular development is a very complex biological process in poultry.At present, the pattern of follicular development in poultry has been understood.However, as an important factor determining egg production, the specific regulation mechanism of follicular development still needs further study.Granulosa cells are the main functional cells in follicles.They can regulate the growth, differentiation and maturation of theca cells and oocytes.They also regulate the growth and development of follicles, maintain normal ovarian function, such as induce ovulation, maintain maturation division, and provide substrates for oocytes.Circular RNAs (circRNAs) are a new type of endogenous specific non-coding RNA, which plays an important role in follicular development.【Objective】The objective of this study was to explore the effects and regulatory mechanism of circ-13267 on apoptosis in egg duck granulosa cells, through regulating the expression of circ-13267 by constructing the overexpression vector, so as to provide the evidence for analysis the regulatory mechanism of egg duck follicular development.【Method】Firstly, the expression levels of circ-13267 in cytoplasm and nucleus of granulosa cells was detected by Q-PCR.The overexpression vector circ-13267-pLCDH was constructed.After transfection of circ-13267 in egg duck granulosa cells, the expression levels of circ-13267, let-7-19, ERBB4, FAS and BCL2 were detected by Q-PCR.The proliferation of egg duck granulosa cells was detected by EdU method after transfection circ-13267-pLCDH and pLCDH-ciR.The linear sequence of circ-13267 or the 3'UTR of ErbB4 was cloned into pmirGLo vector.At the same time, let-7-19 binding site in the wild-type sequence was mutated to obtain the vector expressing the mutant sequence.The targeting relationships between circ-13267 and let-7-19, let-7-19 and ERBB4 were verified by dual luciferase reporter assay, respectively.Then, after transfection of circ-13267-pLCDH and pLCDH-ciR into egg duck follicular granulosa cells, the flow cytometry and Annexin V-FITC were utilized to explore the effects of circ-13267 on duck granulosa cells.【Result】 In duck granulosa cells, circ-13267 was expressed in both cytoplasm and nucleus.The dual luciferase reporter gene assay confirmed that let-7-19 could bind to ERBB4 and down regulate the activity of luciferase; when the binding site of let-7-19 in ErbB4 sequence was mutated, let-7-19 could not inhibit the expression of luciferase, indicating that ERBB4 was a target gene of let-7-19.The results of Q-PCR showed that, after overexpression of circ-13267, the expression of BCL2 gene decreased significantly (＜0.05), while the expression of FAS and ERBB4 gene increased significantly (＜0.05); after overexpression of let-7-19, the expression of ERBB4 gene increased significantly (＜0.05), while after inhibition of let-7-19, the expression of ERBB4 gene decreased significantly (＜0.05).EdU test results showed that the number of follicular granulosa cells in egg ducks decreased significantly after overexpression of circ-13267, it was shown that circ-13267 promoted the apoptosis of follicular granulosa cells in egg ducks.However, after co-transfection of circ-13267 and let-7-19 into egg duck follicular granulosa cells, compared with the control group, there was no significant change in the expression of BCL2 and FAS (＞0.05); however, compared with overexpression of circ-13267, the expression of BCL2 gene decreased significantly (＜0.01) and FAS increased significantly (＜0.01).It was shown that circ-13267 could inhibit the apoptosis of egg duck follicular granulosa cells.In addition, flow cytometry was used to detect the transfected egg duck follicular granulosa cells.Compared with the co-transfection groups of circ-13267 and let-7-19, the number of late apoptotic cells and total apoptotic cells increased significantly (＜0.05), while the number of living cells decreased significantly (＜0.05).【Conclusion】 circ-13267 was expressed in the cytoplasm and nucleus of egg duck follicular granulosa cells.circ-13267 could sponge let-7-19 and target ERBB4 gene, which promoted the apoptosis of egg duck follicular granulosa cells.This results provided a theoretical basis for analysis of the regulatory mechanism of egg duck follicular development.

circRNA; miRNA; egg duck; follicular development; granulosa cells

2021-02-08；

2021-11-17

國家自然科學基金（32072709）、湖北省自然科學基金（2020CFB655）、湖北省技術創新專項（2019ABA084）、國家水禽現代農業產業技術體系（CARS-42-47）、湖北省農業科學院領軍人才項目（L2018017）、湖北省農業科技創新中心項目（2016-620-000-001-023）、湖北省重點研發計劃（2020BBA034）

吳艷，E-mail：wuyanwh@163.com。通信作者皮勁松，E-mail：pijinsong@sina.com

（責任編輯 林鑒非）