茶樹CsHIPP26.1互作蛋白的篩選與驗證

范延艮，王域，劉富浩，趙秀秀，向勤锃，張麗霞

茶樹CsHIPP26.1互作蛋白的篩選與驗證

范延艮，王域，劉富浩，趙秀秀，向勤锃，張麗霞*

山東農業大學園藝科學與工程學院/作物生物學國家重點實驗室，山東泰安 271018

【背景】‘黃金芽’屬于光照敏感型黃化茶樹（）品種，葉片色澤呈現強光黃化、弱光復綠的特點，但葉色響應光照的黃化機制并不明確。前期通過對黃化葉片、遮陰復綠葉片以及常綠品種葉片的蛋白組研究發現，重金屬相關異戊二烯化植物蛋白CsHIPP26.1（TEA000549）的表達響應光照強度，表明CsHIPP26.1可能參與調控‘黃金芽’葉色黃化的光響應過程。【目的】通過篩選與CsHIPP26.1互作的光信號響應相關的蛋白，為葉片色澤響應光照信號變化提供科學依據。【方法】以‘黃金芽’茶樹1芽2葉為材料進行和互作基因的克隆，經酵母雙雜交篩庫，然后將篩選得到的目的蛋白進行酵母雙雜交點對點驗證、體內雙分子熒光互補（BiFC）和體外pull-down等技術進行蛋白互作的進一步驗證。【結果】通過酵母雙雜交對茶樹cDNA文庫進行篩選，共篩選到26個候選互作蛋白，主要集中在細胞組分、結合以及催化活性方面發揮作用，其中生物素合成代謝過程富集程度較高，與光信號通路及葉綠素合成相關的蛋白只有編號為TEA026466.1的bHLH30轉錄因子。克隆bHLH30轉錄因子后發現，該轉錄因子與茶樹光信號傳導途徑蛋白PIF4處于同一進化樹分支，且含有與茶樹PIF4蛋白相同的HLH和ACT結構域，將該bHLH30轉錄因子命名為CsPIF4.2，GenBank登記號為MW116834。進一步通過體外Pull-down蛋白互作和體內雙分子熒光互補（BiFC）驗證發現，CsHIPP26.1和CsPIF4.2蛋白能夠發生互作，并且發生互作的部位在細胞核內。【結論】初步篩選出26個與CsHIPP26.1互作的蛋白，并驗證發現CsHIPP26.1能夠在細胞核內與其中一個光敏色素互作因子CsPIF4.2發生蛋白相互作用。

HIPP；PIF4；蛋白互作；黃化品種；光響應

0 引言

【研究意義】‘黃金芽’屬于光照敏感型黃化茶樹（）品種，葉片色澤受光單一調控[1-2]，呈現“強光黃化，弱光復綠”的特點[3]，但其葉片色澤響應光照強度黃化的機制并不明確。‘黃金芽’新梢黃化性狀穩定[4-5]，目前以‘黃金芽’茶樹品種為母本進行雜交選育的后代絕大部分為光照敏感型黃化茶樹品種[6]，因此，研究‘黃金芽’葉色黃化的分子機制，可以探究光照作為信號調控葉片黃化的分子機制，并且能夠以葉片色澤作為標記性狀，后續開發分子標記，加快優質品種的育種進程，提高育種效率。【前人研究進展】前期對光照敏感型黃化茶樹品種‘黃金芽’不同葉色葉片的篩選以及后續的蛋白組分析[7-8]，發現一個響應光照強度表達的重金屬相關異戊二烯化植物蛋白（heavy metal-associated isoprenylated plant protein，HIPP），該蛋白N端包含金屬結合域（heavy metal-associated domain，HMA，pfam00403.6），C端存在一個被異戊二烯化的保守位點[9]。目前對HIPP的研究較少，僅在模式植物擬南芥中鑒定到45個HIPP基因[10]，根據已有的研究結果，擬南芥中HIPP的功能分為兩種：（a）在重金屬穩態和脫毒機制（特別是鎘耐受性）中發揮作用[11-14]；（b）作為響應低溫、干旱和鹽脅迫的調控元件[15-16]。除此之外，HIPP能夠通過感知脅迫參與調控擬南芥開花時間[17]和擬南芥中植物-病原體相互作用的信號等[18]，在植物生長發育和逆境適應性中發揮重要作用，但并沒有HIPP緩解強光脅迫的相關研究。在前期研究中，將篩選到的克隆后發現，該基因cDNA全長為465 bp，編碼154個氨基酸，蛋白分子量為17 kD；理論等電點為9.13，無跨膜結構域；共有16個磷酸化位點，位于Ser、Thr和Tyr三個氨基酸殘基上；根據基因序列號，將該基因命名為（TEA000549），GenBank登錄號：MK654903；亞細胞定位發現定位于細胞核，并且在‘黃金芽’中，的表達能夠響應光照強度，同時能夠顯著提高轉基因蘋果（）愈傷組織的強光耐受性[9]，因此，可能參與了‘黃金芽’葉色黃化的光響應調控過程，但如何參與葉色的光響應調控途徑并不清楚。【本研究切入點】葉色黃化主要是由于葉綠素含量降低造成的葉色失綠，因此，通過篩選與CsHIPP26.1互作且在調控葉綠素合成過程中發揮作用的蛋白，能夠闡述CsHIPP26.1可能參與的葉色響應光照強度的調控途徑。【擬解決的關鍵問題】以‘黃金芽’茶樹品種為試驗材料，利用前期克隆獲得的序列，構建酵母雙雜交誘餌蛋白載體，通過酵母雙雜交篩庫篩選與其互作的光信號響應相關蛋白，并通過體內、體外等方式驗證蛋白相互作用，為進一步探究HIPP與光照強度調控‘黃金芽’葉色之間的關系提供科學依據。

1 材料與方法

試驗材料取自山東省泰安市茶溪谷有限公司茶園，室內酵母雙雜交、pull-down等于2019—2020年在山東農業大學茶學實驗室進行。

1.1 試驗材料

茶樹材料：采摘種植于山東省泰安市茶園的五年生‘黃金芽’茶樹（）一芽二葉，迅速置于液氮中，-80℃保存。

載體：酵母雙雜交載體：pGBKT7（BD載體）和pGADT7（AD載體），購自大連寶生物公司；雙分子熒光互補（BiFC）載體：pSPYNE-35s和pSPYCE-35s，購自Biovector；Pull-down載體：pET-32a（帶His標簽）和PGEX-4T-1（帶GST標簽），購自上海信裕生物科技有限公司；克隆載體：pEASY BLUNT-Zero，購自北京全式金生物公司。

菌株：大腸桿菌DH5α、大腸桿菌BL21（DE3）、酵母Y2H、根癌農桿菌GV3101均購自上海維地生物技術有限公司。

試劑：Phusion高保真酶（F530S）、dNTP、I、R I、H I、I內切酶、T4連接酶購自美國賽默飛世爾科技公司，多糖多酚RNA提取試劑盒（DP441）和DNA回收試劑盒（DP219）均購自北京天根生化科技有限公司，反轉錄試劑盒RNA to cDNA EcoDry? Premix購自寶生物工程（大連）有限公司。所有引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，編號及序列見表1。

表1 CsHIPP26.1和CsPIF4.2引物

下劃線為酶切位點。The underline is the digestion site.CATATG:I; GGATCC:H I; GAATTC:R I; GTCGAC:I

1.2 試驗方法

1.2.1 基因克隆與載體構建 以‘黃金芽’茶樹品種一芽二葉為材料，根據多糖多酚RNA提取試劑盒（DP441）和反轉錄試劑盒（RNA to cDNA EcoDryTMPremix）的說明書進行茶樹RNA的提取和反轉錄的操作。以茶樹小葉種基因組數據庫（http://tpia.teaplant.org/）中的基因序列為模板設計（TEA000549）和（TEA026466）的特異性引物（表1）。PCR擴增體系為20 μL，包括Phusion（F530S）高保真酶0.2 μL、5×Phusion HF Buffer 4 μL、10 mmol?L-1dNTPs 0.4 μL、正向和反向引物各1 μL、模板DNA 1 μL、ddH2O 12.4 μL。反應條件為98℃ 30 s；98℃ 10 s，60℃ 20 s，72℃ 30 s，35個循環；72℃延伸10 min。采用DNA回收試劑盒（DP219）回收PCR產物后連接至pEASY BLUNT-Zero載體上，然后轉化到大腸桿菌感受態細胞，經篩選抽提質粒后送上海生工生物工程股份有限公式進行測序。

將測序正確的克隆載體質粒與相應的空表達載體分別進行雙酶切，酶切體系為40 μL，包括質粒25 μL、10×FastDigest Buffer 4 μL、各自對應的兩種內切酶各2 μL、ddH2O 7 μL。反應條件為37℃酶切30 min，然后用DNA回收試劑盒分別回收酶切好的目的基因和空表達載體。將回收好的目的基因和對應的載體用T4連接酶進行連接，連接反應體系為10 μL，包括T4 DNA Ligase 0.5 μL、10×T4 Buffer 1 μL、目的片段7.5 μL、表達載體1 μL。22℃反應30 min，轉化大腸桿菌感受態細胞后，PCR篩選陽性重組克隆。

1.2.2 酵母雙雜交 自主激活鑒定：根據趙強[19]的方法，將構建好的BD-載體轉入Y2H酵母中，將轉化好的酵母細胞分別平涂到酵母培養板SD/-Trp、SD/-Trp+X-α-Gal、SD/-Trp+X-α-Gal+100 mmol?L-1金擔子素（Aureobasidin A，AbA）上，30℃倒置培養2—3 d，如果SD/-Trp+X-α-Gal上菌落呈白色或紅色，則無自主激活活性；如果SD/-Trp+X-α- Gal上菌落變藍，則說明有自主激活活性；如果SD/-Trp+X-α-Gal上菌落變藍，而SD/-Trp+X-α-Gal+ 100 mmol?L-1AbA上不生長，則說明自主激活活性可以被AbA抑制，后續雙雜交驗證時需添加一定量的AbA。

酵母雙雜交相互作用的驗證：將轉化好的酵母細胞（雙雜交篩庫以及驗證）平涂到酵母培養板SD/-Trp/-Leu（二缺）上；培養2—3 d后，再次活化到酵母培養板SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade（四缺）上；如果四缺板上不長，則說明蛋白與蛋白可能不互作；如果在四缺板上正常生長，并且在加入X-α-gal和AbA的四缺平板上菌落變藍，則表示蛋白與蛋白發生互作。

1.2.3 蛋白互作驗證 BiFC和Pull-down蛋白互作驗證根據Su等[20]的方法進行。

BiFC體內蛋白互作驗證：分別構建pSPYNE- 35s-和pSPYCE-35s-載體，將pSPYNE-35s、pSPYCE-35s空載體和構建好的pSPYNE- 35s-、pSPYCE-35s-載體分別轉入根癌農桿菌GV3101中，并侵染洋蔥（）表皮，暗培養2—3 d后，在激光共聚焦顯微鏡下觀察結果。

Pull-down體外蛋白互作驗證：分別構建pET-32a- CsHIPP26.1（CsHIPP26.1-His）和PGEX-4T-1-CsPIF4.2（CsPIF4.2-GST）載體，將pET-32a-CsHIPP26.1、PGEX-4T-1-CsPIF4.2、pET-32a和PGEX-4T-1分別轉入大腸桿菌BL21中，用IPTG法誘導蛋白，破碎大腸桿菌并用磁珠純化蛋白后，分別上柱共孵化，洗脫后用Western blotting進行蛋白檢測。

1.2.4 生物信息學預測 篩選到的互作蛋白使用OmicShare Tools網站（https://www.omicshare.com/ tools/home/soft/getsoft/p/7.html）進行GO功能分析。通過茶樹基因組數據庫（http://tpia.teaplant.org/）檢索茶樹中光敏色素互作因子（phytochrome interacting factor，PIF）的同源家族基因，根據酵母雙雜交篩選到的bHLH30（TEA026466.1）蛋白，用MEGA7軟件通過極大似然法（Maximum likelihood）構建PIF家族進化樹，通過Clustalx軟件進行蛋白序列比對，通過MEME網站（http://meme-suite.org/tools/meme）預測同源家族基因蛋白序列的保守位點。

2 結果

2.1CsHIPP26.1茶樹中互作蛋白篩選

通過自激活驗證發現，轉入BD-載體的Y2H酵母能夠在SD/-Trp酵母培養基上正常生長，而且能夠在SD/-Trp+x-α-gal的酵母培養基上生長且變藍。x-α-gal是酵母半乳糖苷酶（MEL1）的顯色底物，GAL4酵母雙雜交系統的報告基因激活后，能夠發生互作的陽性克隆直接在含有x-α-gal的固體培養基上呈藍色[21]。因此，單轉BD-的Y2H變藍表明構建于BD載體的具有自激活反應；AbA是酵母雙雜交陽性克隆子篩選用的藥物選擇性標記，能夠有效抑制酵母雙雜交中的自激活反應[22]，在添加了100 mmol?L-1AbA的SD/-Trp+x-α- gal+100 mmol?L-1AbA酵母培養基上，酵母的生長被抑制，表明100 mmol?L-1濃度的AbA能夠抑制BD-的自激活反應（圖1）。

圖1 BD誘餌蛋白自激活檢測

以AbA濃度為100 mmol?L-1的酵母篩庫培養基（二缺與四缺）進行茶樹基因文庫篩選，經酵母菌落PCR檢測并送樣測序后，初步獲得候選互作蛋白26個（表2）。分析發現，篩選到的26個互作蛋白中，共有16個蛋白能夠注釋到具體KEGG通路中，其中有3個信號通路相關蛋白，3個類黃酮、花青素相關通路蛋白，2個核糖體相關蛋白，2個轉運相關蛋白，2個葉酸合成相關蛋白和1個生物素合成相關蛋白；對26個篩選蛋白進行GO分析發現（圖2），26個候選蛋白主要集中在細胞組分、結合以及催化活性方面，其中生物素合成代謝過程富集程度較高。但與光信號通路及葉綠素合成相關的蛋白只有編號為TEA026466.1的bHLH30轉錄因子，因此選擇該蛋白作進一步分析。

2.2 CsPIF4.2的克隆與鑒定

為進一步驗證篩選到的與CsHIPP26.1互作的bHLH30（PIF4-like）轉錄因子蛋白，首先將該轉錄因子（TEA026466）進行基因克隆，克隆后發現其全長1 098 bp，編碼365個氨基酸；然后將茶樹小葉種基因組數據庫（http://tpia.teaplant.org/）找到的PIF蛋白與該轉錄因子（TEA026466）進行進化樹與結構域分析，發現篩庫得到的bHLH30蛋白（TEA026466）與茶樹PIF4蛋白（TEA016807）處于同一進化樹分支，具有相似的保守結構位點（Motif），并含有與PIF4相似度極高的bHLH和ACT結構域（圖3）。根據茶樹小葉種基因組數據庫的預測名稱以及基因序列號大小排序，將篩庫得到的該蛋白命名為CsPIF4.2（TEA026466），并將克隆到的基因序列提交到NCBI，GenBank登記號：MW116834。

圖3 茶樹PIFs進化樹分析與蛋白序列比對

2.3 CsHIPP26.1和CsPIF4.2蛋白互作驗證

將克隆到的構建到pGADT7（AD）質粒載體中，然后將pGBKT7::（- BD）和pGADT7::（-AD）質粒共同轉化進酵母感受態。結果顯示，在100 mmol?L-1AbA的選擇下，只有共轉了-BD和- AD載體的酵母才能正常生長變藍，而共轉- BD和空AD載體的酵母以及共轉空BD和- AD載體的酵母在選擇培養基上均不能正常生長（圖4-A），以上結果說明CsHIPP26.1和CsPIF4.2蛋白能夠在酵母體內結合并啟動下游報告基因的表達，可以在酵母內發生互作。

為進一步驗證蛋白互作的真實性，采用體外蛋白互作的方法（Pull-down）和體內蛋白互作的方法（雙分子熒光互補技術，BiFC）進行互作的進一步驗證。從圖4-B可以看出，在Input中，第一列CsHIPP26.1蛋白和CsPIF4.2蛋白都加入，但并未經過洗脫，因此上清液中存在這兩種蛋白；第二列CsHIPP26.1蛋白與GST蛋白在沒有洗脫的情況下也能共存。在Output中，CsPIF4- GST能夠將CsHIPP26.1蛋白拉下來，而單獨的GST蛋白不能將CsHIPP26.1蛋白拉下來，說明CsHIPP26.1蛋白能夠在體外與CsPIF4.2蛋白結合。通過BiFC驗證，激光共聚焦顯微鏡下觀測發現（圖4-C），在pSPYNE- 35s::與pSPYCE-35s以及pSPYNE-35s與pSPYCE-35s::共同侵染的洋蔥表皮細胞中，在激發光下并無熒光發生，說明單獨的N端或者C端并不能引起黃色熒光的激發，從而排除BiFC體系本身失效的影響。而在pSPYNE-35s::與pSPYCE-35s::共同侵染的洋蔥表皮細胞中，在激發光下能夠在細胞核中看到黃色熒光，說明CsHIPP26.1蛋白和CsPIF4.2蛋白可以在洋蔥表皮細胞內發生互作，且發生互作的部位位于細胞核內。

“+”表示加入，“-”代表不加入，只有CsHIPP26.1-His和CsPIF4.2-GST共同加入后才可以在最后的洗脫液中檢測到；同時只有在pSPYNE-35s::CsHIPP26.1與pSPYCE-35s::CsPIF4.2共同侵染的洋蔥表皮細胞中才能觀察到黃色熒光，說明CsHIPP26.1和CsPIF4.2能夠互作

3 討論

‘黃金芽’屬于光照敏感型黃化茶樹品種，強光下葉片易出現生理脅迫現象[3,23]，而重金屬相關異戊烯化蛋白（HIPP）則能夠緩解低溫、鹽和干旱等逆境脅迫對植物的傷害[10]，還能夠通過感知脅迫參與多種植物生理調控過程[18]。筆者前期通過蛋白組分析得到一個定位于細胞核且在‘黃金芽’黃化葉片中高表達的重金屬相關異戊烯化蛋白CsHIPP26.1（TEA000549），其基因表達量隨著光照強度的增強而增加[9]。通過酵母雙雜交對CsHIPP26.1蛋白進行了茶樹cDNA文庫篩選（表2），得到一個與其互作的光敏色素互作因子（CsPIF4.2，TEA026466）蛋白。前人研究發現，PIF4對光敏色素B（PhyB）介導的光信號對細胞核中葉綠素合成以及光合系統基因的表達具有負調控作用[24-27]，例如，在光誘導擬南芥的去黃化過程中，PIF4能夠抑制葉綠素合成前期、的表達，從而負調控葉綠素的合成[28-29]。PIF4作為PhyB直接結合的下游信號因子，在細胞核中與處于生物激活狀態的PhyB-Pfr結合后，PIF4蛋白發生磷酸化，隨后26S蛋白酶體降解磷酸化的PIF4蛋白，被PIF4蛋白抑制的光形態建成相關基因開始表達[30-31]，由于CsHIPP26.1與CsPIF4.2在細胞核中發生蛋白的相互作用，推測CsPIF4.2通過與CsHIPP26.1互作以穩定CsPIF4.2的蛋白結構，從而降低光下26S介導的CsPIF4.2蛋白的降解，最終抑制了‘黃金芽’葉綠素合成以及葉綠體發育和光合系統的組裝。此外，PIF4在植物抵御逆境脅迫過程中也發揮了重要作用，番茄植株中PIF4通過感知光信號正調控植物的耐低溫能力[32]；高溫下，PIF4主要通過影響IAA水平進而調控擬南芥下胚軸伸長等形態特征；PIF4還能抑制氣孔發育正向調節因子SPCH（Speechless）的表達，進而抑制氣孔張開，減少高溫對植物的傷害[33]；植株耐高溫特性還受到植株體內PIF4積累量以及PIF4對靶標基因的激活能力的制約[34-35]。綜上，CsHIPP26.1通過與CsPIF4.2發生蛋白的相互作用，一方面可能通過穩定CsPIF4.2的蛋白結構，從而負調控葉綠素合成及光和系統基因表達等光形態建成過程；另一方面，還有可能通過穩定蛋白結構，從而增強‘黃金芽’黃化葉片的抗逆性。本研究發現，CsHIPP26.1蛋白能夠在細胞核中與CsPIF4.2蛋白發生互作，推測CsHIPP26.1蛋白通過在細胞核中結合CsPIF4.2蛋白并穩定其結構。這一結果為CsHIPP26.1響應光強從而調控下游相關生理過程變化提供了科學依據，但CsHIPP26.1是否能夠促進光下CsPIF4.2蛋白的穩定性還需做進一步探究。

4 結論

通過酵母雙雜交，從茶葉cDNA文庫中篩選到與CsHIPP26.1互作的候選互作蛋白26個。經驗證，CsHIPP26.1能夠與光敏色素互作因子CsPIF4.2蛋白互作，并且兩者的蛋白相互作用發生在細胞核內。

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Screening and Verification of CsHIPP26.1 Interaction Protein in Tea Plant

FAN YanGen, WANG Yu, LIU FuHao, ZHAO XiuXiu, XIANG QinZeng, ZHANG LiXia*

College of Horticulture Science and Engineering, Shandong Agricultural University/State Key Laboratory of Crop Biology, Tai’an 271018, Shandong

【Background】Huangjinya is a light sensitive chlorotic tea () variety, the leaf color of which presents yellow under strong light and presents green under weak light, but the chlorotic mechanism of leaf color in response to light is not clear.Previous proteomic studies on etiolated leaves, shaded green leaves and evergreen leaves found that the expression of heavy metal-associated isoprenylated plant protein CsHIPP26.1 (TEA000549) responded to light intensity, indicating that CsHIPP26.1 may be involved in regulating the light response process of leaf color etiolation of Huangjinya.【Objective】The proteins related to the light signal response interacting with CsHIPP26.1 were screened to provide a scientific basis for leaf color response to light signal changes.【Method】The gene were cloned from one bud and two leaves of Huangjinya.And the screened target protein was further verified by yeast two hybrid point-to-point verification,bimolecular fluorescence complementarity (BiFC), andpull-down techniques.【Result】The tea cDNA library was screened by yeast two hybrid, and a total of 26 candidate interaction proteins were screened, which mainly played a role in cell components, binding and catalytic activity.Among them, the enrichment degree of biotin anabolism process was high, and the proteins related to light signal pathway and chlorophyll synthesis were only the bHLH30 transcription factor, and its gene ID was TEA026466.1.After cloning the gene of bHLH30 transcription factor, it was found that the transcription factor was in the same evolutionary tree branch as tea light signal transduction pathway protein PIF4, and contained the same HLH and ACT domains as tea PIF4 protein.Therefore, the bHLH30 transcription factor was named CsPIF4.2, GenBank registration number: MW16834.And through the pull-down protein interactionand bimolecular fluorescence complementarity (BiFC), it was found that CsHIPP26.1 and CsPIF4.2 proteins could indeed interact, and the site of interaction was in the nucleus.【Conclusion】26 proteins interacting with CsHIPP26.1 were preliminarily screened, and it was found that CsHIPP26.1 could interact with one of the phytochrome interacting factors CsPIF4.2 in the nucleus.

HIPP; PIF4; protein interaction; yellowing varieties; light response

2021-08-20；

2021-12-10

山東省現代農業產業技術體系創新團隊項目（SDAIT-19-05）、山東省“雙一流”獎補資金項目（SYL2017YY03）、魯渝科技協作計劃項目（2020LYXZ005）

范延艮，E-mail：876562801@qq.com。王域，E-mail：1113405407@qq.com。范延艮和王域為同等貢獻作者。通信作者張麗霞，E-mail：lxzhang@sdau.edu.cn

（責任編輯 趙伶俐）