慢生根瘤菌及其與花生共生機制研究進展

吳月，隋新華，戴良香，鄭永美，張智猛，田云云，于天一，孫學武，孫棋棋，馬登超，吳正鋒*

慢生根瘤菌及其與花生共生機制研究進展

吳月1，隋新華2，戴良香1，鄭永美1，張智猛1，田云云1，于天一1，孫學武1，孫棋棋1，馬登超3，吳正鋒1*

1山東省花生研究所，山東青島 266100；2中國農業大學生命科學學院，北京 100193；3濟寧市農業科學研究院，山東濟寧 272009

氮是植物生長發育所必需的大量元素之一，豆科植物通過與根瘤菌的共生固氮獲得氮素。這種共生關系的建立包括結瘤和固氮兩個過程，涉及復雜的互作調控機理，并受環境因素的顯著影響。花生與慢生根瘤菌的共生對花生生產尤為重要，具有較多特異和未知的共生機制。本文綜述了慢生根瘤菌及其與花生共生的相關內容，具體包括：（1）花生的慢生根瘤菌多樣性和基因組功能；（2）花生與慢生根瘤菌的共生機制，包括慢生根瘤菌的裂隙侵染及與花生的共生信號交流，花生的結瘤固氮和根瘤數調控機制；（3）田間環境因素（土壤氮素、pH、溫度、水分）對花生結瘤固氮及產量的影響。本文從慢生根瘤菌、慢生根瘤菌與花生的共生以及在花生田間的應用三方面指出目前研究中存在的問題主要為：針對花生的慢生根瘤菌基因組功能研究較少、慢生根瘤菌與花生互作調節機理細節未知、慢生根瘤菌菌劑田間應用利用率差等?；诖?，未來研究重點應該集中在花生慢生根瘤菌基因組及基因功能分析；慢生根瘤菌與花生的信號交流、根瘤數調節和營養交換機制；與根瘤固氮規律相配合的化學氮肥合理施用技術、通過合成生物學手段獲得適用于花生種植的新型根瘤菌劑等方面。本文為深入了解豆科植物與根瘤菌的共生機制、提高豆科作物結瘤固氮效率和產量、減少化學氮肥施用和改善農業生態環境等提供理論基礎。

慢生根瘤菌；花生；共生固氮；結瘤固氮機制；多樣性；環境因素

0 引言

大氣中存在78%的游離氮氣，但植物卻只能吸收利用化合態氮。在這些化合態氮中，生物固定的氮占據主導地位，約為70%[1]。固氮生物主要是原核生物中細菌和古菌的某些屬種，按照與植物的關系這些屬種可以分為共生固氮、自生固氮、聯合固氮和內生固氮等幾種類型[2]。根瘤菌與豆科植物的共生固氮是能力最強的共生體系，為植物提供生長所需60%—65%氮素，在可持續農業生產和生態環境保護中意義重大[3-4]。固氮根瘤菌屬于原核生物細菌域（）、變形桿菌門（）、阿拉法-變形桿菌綱（α-）和貝塔-變形桿菌綱（β-）、根瘤菌目（）和伯克霍爾德氏菌目（），至2020年7月已有360多個種[5]。根瘤菌是一類廣泛分布于土壤中的革蘭氏陰性細菌，具有可運動、無芽孢、好氧等特性[6]。比較常見且占比例最大的根瘤菌主要屬于根瘤菌屬（）、慢生根瘤菌屬（）、中慢生根瘤菌屬（）和中華根瘤菌屬（）等[4]。

花生（L.）是世界上種植最廣的豆科作物之一[7]。能夠與花生建立共生關系的根瘤菌主要分布在慢生根瘤菌屬，研究證明花生-慢生根瘤菌共生體系的固氮量相當于純氮100—152 kg·hm-2，可滿足花生生長需要氮量的30%—80%，并提高后茬作物產量[8]。因此，慢生根瘤菌在減少化學氮肥的前提下，能夠解決土壤生態問題，維持土壤環境可持續發展，在花生栽培上有著較高的應用潛力和價值。

1 花生的慢生根瘤菌

1.1 花生的慢生根瘤菌多樣性

近幾年，關于花生根瘤菌多樣性的研究較多，發現這些根瘤菌主要屬于慢生根瘤菌屬（）。國外對花生慢生根瘤菌多樣性的研究主要集中在阿根廷和非洲等花生種植國家。阿根廷花生慢生根瘤菌的系統發育地位與.、相近[9]。摩洛哥花生慢生根瘤菌的系統發育地位與、、、相近[10]。同時也發現了少量新種慢生根瘤菌，例如和等[11-12]。我國花生根瘤菌也屬于慢生根瘤菌屬，優勢種群為、和。山東省和河北省花生慢生根瘤菌優勢種群為，河南省的優勢種群為[6]；江蘇、廣東和廣西三省花生慢生根瘤菌優勢種群為[13]；四川省花生慢生根瘤菌在系統發育上與關系最近[14]。此外，在我國也發現了大量慢生根瘤菌新種，例如、、、和等，這說明我國花生的慢生根瘤菌具有較大遺傳多樣性，潛在慢生根瘤菌屬的新種較多[15-18]。

1.2 花生的慢生根瘤菌基因組功能

目前，關于花生的慢生根瘤菌基因組功能研究較少。李永華[19]根據結瘤基因和固氮基因將花生的慢生根瘤菌分為I型和II型兩種類型，共生表型檢測結果顯示II型慢生根瘤菌接種花生形成的根瘤數為I型根瘤菌接種處理的1.5—2倍。比較基因組學分析發現I型和II型慢生根瘤菌有338個共生相關基因與上述分型結果一致；所有II型慢生根瘤菌具有共生質粒；I型和II型慢生根瘤菌在影響表達的重要區域上游的UAS位點及啟動子區域差異較大。推測這些基因組特征可能與兩種類型慢生根瘤菌的根瘤數差異相關。此外，筆者通過遺傳操作方法發現II型慢生根瘤菌CCBAU 53363T（）多個染色體基因正調控花生結瘤，qRT-PCR分析結果表明CCBAU 53363T的這些染色體基因通過延長花生共生信號通路中AhSYMRK蛋白（symbiosis receptor- like kinase）表達的時間、提高花生耐受根瘤數自調控系統AON（autoregulation of nodulation）和乙烯調控系統的反饋調節而誘導花生大量結瘤[20]。

2 慢生根瘤菌與花生的共生機制

2.1 慢生根瘤菌對花生的侵染

植物根部在生長時會向土壤中釋放氨基酸、類黃酮等有機分泌物，根瘤菌對這些分泌物做出反應并通過趨化作用運動到植物根系，在根瘤菌多糖（環葡聚糖，類似于凝膠和黏附素）與植物凝集素（根瘤菌多糖特異性受體）匹配性識別之后，植物凝集素幫助根瘤菌定殖在根表及根毛上，為侵染根系做準備[21-23]。對于慢生根瘤菌來說，鈣結合黏附素細胞表面蛋白幫助慢生根瘤菌吸附在花生根表[24]。此外，菌體的生長狀態也對附著效果存在較大影響，即處于生長對數期末、穩定期初的慢生根瘤菌具有最強的花生根表定殖能力[25]。

比較常見的根瘤菌對豆科植物的侵染方式為根毛侵染，根毛侵染是指根瘤菌經由豆科植物根毛進入根部并形成根瘤的過程。這種侵染模式主要發生在含羞草亞科和蝶形花亞科的植物上，如豌豆（）、大豆（）、截型苜蓿（）和日本百脈根（）等[25]。在侵染過程中，根瘤菌首先誘導植物根毛發生卷曲，并通過釋放植物細胞壁降解酶侵入到根毛細胞中[26]；隨后，根瘤菌以侵染線（infection thread，IT）的形式經由根毛細胞和皮層細胞，進入根瘤原基細胞[27-29]。另一種侵染方式為裂隙侵染，裂隙侵染是指根瘤菌通過植物根部表皮裂開的傷口或側根與主根之間的裂隙進入到植物根部并形成根瘤的過程。該侵染類型主要屬于亞熱帶豆科植物，包括花生屬（）、田菁屬（）和合萌屬（）等。目前研究較多的是合萌共生體系，在該體系中光合慢生根瘤菌通過合萌腋生根毛與主根之間的裂隙進入根表皮細胞間隙并大量繁殖形成侵染袋，侵染袋中的光合慢生根瘤菌通過皮層細胞間隙進入位于皮層的根瘤原基細胞中[30]。慢生根瘤菌與花生的共生也屬于裂隙侵染類型，但關于該共生體系的侵染路徑研究較少，僅了解到慢生根瘤菌經由花生側根與主根之間的裂隙進入到花生根部細胞間隙，并通過細胞間隙向根瘤原基運動[31]。

2.2 慢生根瘤菌與花生的信號交流

對于根毛侵染體系來說，豆科植物首先向土壤中釋放類黃酮，類黃酮與根瘤菌的NodD蛋白識別并結合，誘導根瘤菌結瘤基因（）表達合成結瘤因子（nod factors，NF）[32-33]。結瘤因子與植物根表的結瘤因子受體蛋白（nod factor receptor，NFR）正確識別后激活植物共生信號通路，在該信號通路中SymRK（leucine-rich repeat receptor kinase）信號轉導蛋白首先被誘導表達，進而將信號傳入根毛的細胞核中并經由Ca2+振蕩激活Ca2+依賴蛋白激酶CCaMK（Calcium calmodulin-dependent protein kinase）[34]。CCaMK一方面通過調節與肌動蛋白重排相關的Nap1蛋白及轉錄調節因子NSP1、NSP2和NIN（nodule inception）的表達而調控侵染線在根毛中的形成及延伸，另一方面通過細胞分裂素等信號分子調節轉錄調節因子NSP1、NSP2和NIN的表達而調控根部皮層細胞分裂促進根瘤原基形成，為根瘤菌侵入根瘤原基細胞做準備[35]。此外，根瘤菌胞外多糖EPS（exopolysaccharides）作為侵染線基質的重要組成成分參與到了侵染線的延伸過程中，同時作為植物防御體系抑制劑提高了根瘤菌在侵染線和根瘤細胞中的存活率和共生效率[36-37]。

對于慢生根瘤菌與花生的裂隙侵染體系來說，研究發現結瘤因子缺陷型慢生根瘤菌sp.SEMIA 6144 V2突變體和野生型菌株sp.BTAI 1在與花生共生時分別表現出了不結瘤和結瘤的性質，說明花生的裂隙侵染過程是否需要結瘤因子還未完全確定[38-39]；此外，也有研究發現結瘤因子受體蛋白AhLYR3和AhEPR3（EPS receptor 3）廣泛存在于花生植株中并在共生時顯著表達，推測該蛋白在慢生根瘤菌-花生共生時發揮著重要作用[40-41]；對于花生共生信號通路來說，磷酸化的AhSYMRK蛋白能夠幫助慢生根瘤菌侵染花生根部和根瘤原基細胞[42]；AhCCaMK蛋白通過調控轉錄調節因子AhCYCLOPS的磷酸化而控制下游蛋白AhHK1（Histidine Kinase1）、AhNIN及AhENOD40表達，最終調節根瘤的形成和固氮以及類菌體的分布和分化[43-45]；、、等基因也參與到了花生與慢生根瘤菌共生關系的建立中[46]。此外，有研究證明慢生根瘤菌EPS缺陷型突變體接種花生的根瘤數、地上干重、組織中氮含量及根瘤細胞中類菌體密度均顯著低于野生型菌株處理，說明EPS也影響了慢生根瘤菌與花生的共生效率[47-48]。

2.3 花生根瘤的形成

對于根毛侵染體系來說，當侵染線延伸至根瘤原基處時會將根瘤菌釋放入根瘤原基細胞中，隨后，根瘤菌隨著根瘤原基細胞的不斷分裂而大量繁殖，最終充滿整個根瘤細胞。在此過程中，根瘤菌脫去細胞壁并被源于植物的共生體膜包裹，分化為具有固氮能力的共生體[49]。對于裂隙侵染體系的花生-慢生根瘤菌共生來說，慢生根瘤菌經由花生細胞間隙運動到位于皮層的根瘤原基處，通過改變花生細胞壁結構進入到根瘤原基細胞中[31,50]。慢生根瘤菌原有的細胞壁被花生分泌的細胞壁降解酶水解，隨著水解小孔的逐步變大，根瘤菌原生質體被源于花生的共生體膜包裹，最終膨脹、發育為球狀成熟共生體。當所有根瘤菌發育為共生體后，根瘤完全成熟，固氮能力達到頂峰[50]。

根據形態結構可將成熟根瘤分為無限型根瘤（不定型根瘤）和有限型根瘤（定型根瘤）。無限型根瘤存在明顯的結構分層，包括具有持續分裂分化能力的頂端分生區（I）、被根瘤菌侵染的侵染區（II）、同時含有未分化和分化類菌體的過渡區（Ⅱ—Ⅲ）、充滿成熟類菌體且具有高效固氮能力的固氮區（Ⅲ）以及類菌體大量解體并喪失固氮能力的衰老區（Ⅳ）[51]。有限型根瘤為球形，無明顯結構差異，主要由表皮層、分生組織、輸導組織和含菌組織（中央固氮區，III）構成。其中，皮層起到儲存養分、保護根瘤的作用；分生組織僅存在于根瘤形成早期，隨后分化為其他組織；疏導組織負責在植物和根瘤間傳輸水分和養分；中央固氮區包括少量不含類菌體的根瘤細胞和大量充滿類菌體的根瘤細胞[52-53]?；ㄉ鰹榈湫偷挠邢扌透觯睆?—5 mm，中央固氮區細胞較大、含有細胞核、充滿膨脹的球狀共生體[20,54-55]。此外，花生根瘤細胞中含有與類菌體膜緊密接觸的脂質體，這些脂質體通過β-過氧化和乙醛酸降解途徑為類菌體供給碳源[56-57]。

2.4 花生根瘤固氮機理

成熟根瘤的共生體中含有固氮酶，固氮酶能夠在微氧環境中將N2轉化為NH3[58-59]。固氮酶由鉬鐵蛋白和鐵蛋白兩部分構成，鐵蛋白是由2個相同亞基構成的同源二聚體；鉬鐵蛋白由4個亞基構成，并含有2個鉬原子和不同數量的Fe-S簇。在固氮過程中，鐵氧還蛋白將電子傳遞給固氮酶的鐵蛋白組分，鐵蛋白在水解ATP的同時將固氮酶的鉬鐵蛋白還原，鉬鐵蛋白將電子傳遞至分子態氮并將其還原為NH3[60]。NH3與共生體膜內的H+結合形成NH4+，隨后NH4+與植物細胞中的谷氨酸結合形成谷氨酰胺為植物提供氮源，或者谷氨酰胺將氨基傳遞給天冬氨酸以天冬酰胺的形式供給氮源[61]。根瘤菌的固氮基因（和）直接參與上述固氮過程，這些基因呈簇狀排列，一般為，其中和參與合成鉬鐵固氮酶的Fe-S聚簇，基因調控固氮酶成熟，操縱子調節固氮基因的表達[62]。由于固氮酶固定1分子N2需要消耗16分子ATP，因此類菌體的固氮反應需要宿主植物持續提供碳源[63]。植物光合作用固定的碳以四碳二羧酸的形式提供給類菌體，如蘋果酸在蘋果酸酶和丙酮酸脫氫酶催化下生成乙酰輔酶A，用于類菌體三羧酸循環（tricarboxylic acid cycle，TCA）形成ATP[64]。此外，植物細胞也為類菌體提供大量的鐵、硫、鉬、磷、鎂、錳、鋅等多種礦質元素以及各種糖類、氨基酸和精胺等物質[65-68]。

目前，關于花生根瘤固氮機理的研究較少，研究發現花生根瘤鮮重、豆血紅蛋白含量和固氮酶活性均與根瘤固氮積累量和供氮比例以及莢果產量正相關[69]?；ㄉ蛞簿哂杏绊懜龉痰富钚缘哪芰43]。此外，不同花生慢生根瘤菌對花生根瘤固氮酶活性及動態變化影響顯著[20]。

2.5 花生對根瘤數的調控

雖然根瘤菌為豆科植物提供大量氮素，但由于根瘤固氮消耗過高的能源成本，因此植物進化出了多種機制嚴格控制根瘤數量。其中，最為重要的是植物根瘤數自調控系統AON，在AON調控系統中共生信號通路的下游蛋白NIN調節植物合成結瘤抑制蛋白CLE （CLAVATA3/endosperm-surrounding region-related），該蛋白將信號傳遞到植株地上部位并激活葉片中的NARK受體激酶（nodule autoregulation receptor kinase），NARK誘導KAPP蛋白（kinase-associated protein phosphatase）合成結瘤抑制因子SDI（shoot-derived inhibitor）或細胞分裂素等信號分子，這些信號分子再次將信號傳遞回根部并通過抑制NIN等共生信號通路中下游蛋白的表達而阻斷結瘤[70-72]。第二種根瘤數調節系統是植物激素信號調節網絡，在該調控網絡中細胞分裂素及局部積累的生長素具有促進根瘤發育的能力；乙烯、茉莉酸、脫落酸和赤霉素抑制根毛侵染體系中侵染線的形成和根瘤發育[73]。此外，植物激素間也存在相互調節作用，例如過量分泌的細胞分裂素和生長素促進乙烯大量合成，進而通過乙烯信號調節通路激活植物免疫反應而反饋抑制根瘤形成和發育[74]。

對于花生根瘤數調控系統來說，在結瘤前期，AON調控系統中的AhCLE13、AhSUNN、AhKLAVIER蛋白表達量上調，說明AON系統在花生中發揮了調控作用[20, 41]。在植物激素信號網絡中，細胞分裂素通過調節花生細胞分裂素受體AhHK1的表達參與根瘤原基形成[44]；此外，與乙烯相關的乙烯響應因子AhERF（ethylene response factor）、乙烯信號調節因子AhEIN2（ethylene signaling protein）等蛋白在花生結瘤時大量表達，參與調控根瘤原基細胞分裂、分化及根瘤發育[20, 45]。

3 影響慢生根瘤菌與花生結瘤固氮的環境因素

3.1 氮

化學氮肥的施用對豆科作物產量的提升尤為重要，然而過量施氮卻影響作物產量和品質的提高，引起土壤酸化板結和地下水污染[75]，并抑制作物結瘤和根瘤固氮。研究表明，土壤中高濃度的氮（尤其是硝態氮）通過抑制根瘤菌侵染、根瘤原基形成和生長而降低植物結瘤數量，通過降低豆血紅蛋白的合成而降低根瘤固氮酶活性并加速根瘤衰老和崩解[76-78]。進一步研究證明這種抑制過程涉及植物氮反饋調控系統，該系統能夠保證植株在土壤氮素充足的情況下免于浪費能量供給根瘤菌進行結瘤和固氮。在氮反饋調控系統中，過量的氮素首先誘導植物根部大量表達CLE蛋白，該蛋白通過AON調控系統中的HAR1、NARK和SUNN蛋白促進細胞分裂素或生長素等信號激素的合成，最終反饋抑制根部NIN蛋白表達以及根瘤形成[77, 79-83]。

研究證明2.5 mmol/棵KNO3能夠顯著降低花生根瘤數量；5 mmol/棵KNO3幾乎完全抑制了花生結瘤，僅有的幾個根瘤缺少豆血紅蛋白、無固氮能力[20]。這說明由硝酸鹽誘導的氮反饋調節機制在花生-慢生根瘤菌共生體系中依舊發揮著降低根瘤數和根瘤固氮酶活性的作用，但具體調節機制還需進行深入研究。此外，也有研究發現，結莢期花生根瘤的固氮速率及根瘤供氮量達到最高，此時過高的氮肥供應會通過氮反饋調控系統抑制根瘤固氮，促進根瘤早衰[84-85]。因此，根據花生氮反饋調節機制和根瘤固氮動態，在花生的不同生育時期合理施用氮肥是一項符合花生生產實際的舉措。

3.2 pH

土壤酸化是農業種植中面臨的一個尤為嚴重的問題，而連作的豆科作物更能加速這種酸化進程，因此土壤pH對豆科作物與根瘤菌共生固氮的影響值得關注。研究表明，當pH低于4.5時，根瘤菌的生長和存活量相對較少[86-87]；當pH為5.0時，根瘤菌與豆科植物的共生效率受到顯著抑制[88]；此外，酸化土壤通過降低植物類黃酮等物質誘導根瘤菌結瘤因子合成的效率而阻斷二者共生關系建立[89]。耐酸根瘤菌是一類可以在酸化土壤中與花生正常結瘤和固氮的慢生根瘤菌，這類根瘤菌通過增強質子排斥及細胞質緩沖能力、合成酸休克蛋白、提高膜滲透能力、調控鈣離子代謝及谷氨酰胺合成酶/谷氨酸合成酶途徑等方式將細胞質的pH維持在中性水平（pH 7.2—7.5），進而維持根瘤菌正常定殖和共生能力[87, 90-96]。因此，耐酸慢生根瘤菌可以作為潛在根瘤菌劑菌種應用于酸化土壤的花生種植中，為提高酸化土壤中豆科作物固氮效率、減少氮肥施用、延緩土壤酸化提供可能。

3.3 溫度

土壤溫度對根瘤菌的存活、結瘤和固氮能力存在較大影響，大部分根瘤菌最適生長溫度為28—31℃[87]。同時溫度也影響了根瘤菌對植物根毛的侵染、類菌體分化、根瘤結構和功能[97-98]?；ㄉ?慢生根瘤菌的共生對根溫較其他豆科植物更為敏感。研究發現，37℃時花生慢生根瘤菌sp.ATCC 10317、SEMIA 6144和TAL 1371生物量輕微下降，細胞內低分子量的低聚糖含量顯著增加，中性葡聚糖的合成被完全抑制。40℃處理4 h時，根瘤菌細胞會合成兩個分子質量分別為17 kD和18 kD的熱休克蛋白[99]。對于花生來說，當根溫為40℃時花生結瘤和固氮能力被完全抑制[100]。因此，施加根瘤菌劑時需要考慮田間溫度，以保證根瘤菌在土壤中的存活率以及與花生的共生效率。

3.4 水分

干旱脅迫是限制作物生長發育和生產的重要環境因素之一，同時也顯著降低豆科作物的結瘤和固氮效率[101]。研究證明干旱脅迫通過韌皮部水體積流量影響豆科作物體內的碳代謝、根瘤透氧性和氮反饋體系等3個方面，進而限制根瘤的固氮能力[102]。對于花生來說，干旱脅迫影響花生生長，降低植株地上干重、根瘤數和含氮量；誘導植株大量合成H2O2，損害脂質和蛋白質；抑制根瘤的發育程度和固氮能力[101, 103]。因此，在花生結瘤和固氮過程中應保證充足的水分供應，為花生結莢準備足夠的營養物質。

4 存在問題及展望

慢生根瘤菌與花生共生機制的研究及田間生產存在如下問題：（1）花生慢生根瘤菌基因組遺傳進化及功能方面，隨著基因組測序技術及分析手段的發展，目前初步了解了花生慢生根瘤菌基因組功能及進化機制[19]，但缺乏試驗驗證和系統的深入研究；（2）共生信號交流方面，部分研究證明花生與慢生根瘤菌的共生需要結瘤因子，但另一部分研究卻表明不分泌結瘤因子的根瘤菌也能與花生結瘤共生[38-39]，因此結瘤因子是否發揮功能還需進一步證明。此外，雖然在花生共生信號通路中發現了一些調控結瘤的蛋白，但這些蛋白具體調控機制依舊未知；（3）侵染路徑方面，對于裂隙侵染來說，研究中關注更多的是光合慢生根瘤菌在合萌上的侵染路徑，發現根瘤菌的熒光標記配合植物組織的激光共聚焦顯微觀察是最簡便的檢測方法[30]。但由于熒光基因及其他標記基因在慢生根瘤菌中遺傳穩定性差，難以標記成功。因此，為了了解慢生根瘤菌在花生上的侵染路徑，首先需要克服慢生根瘤菌遺傳標記這一問題；（4）根瘤數量調節方面，幾乎所有研究均認為只有豆科植物調控了根瘤數，筆者發現花生慢生根瘤菌具有影響花生根瘤數的能力[20]，說明慢生根瘤菌-花生共生體系可能存在特殊的共生機制，但具體機制未知；（5）養分交流方面，根瘤菌與豆科植物養分交流的研究主要集中在根毛侵染體系上，完全忽略了裂隙侵染體系。而早期研究發現花生根瘤細胞中含有一種特異的參與碳源供應的脂質體[56]，說明花生-慢生根瘤菌的共生可能存在某種較為特殊的碳-氮源交換路徑，值得進行深入研究。（6）根瘤菌菌劑方面，市面上已經出現了一些用于花生栽培的慢生根瘤菌菌劑，但這些菌劑存在普適性低、花生品種匹配性差、結瘤固氮效率低等問題；（7）化學肥料施用方面，化學氮肥的大量施用，導致慢生根瘤菌與花生的共生固氮作用被顯著抑制，造成了資源浪費和生態環境污染；（8）遺傳育種方面，目前幾乎所有育種研究均集中在花生的高產、高油、高油酸、抗病及抗逆等方面，完全忽略了花生的高效結瘤和固氮等特性以及慢生根瘤菌與花生品種的匹配性。

基于上述問題，未來的研究重點及方向應該集中在以下幾個方面：（1）花生的慢生根瘤菌基因功能，找到適合編輯慢生根瘤菌基因組的遺傳操作手段，檢測這些基因與花生共生表型的關系，通過測定突變體的轉錄組來分析被突變基因的功能及可能存在的調控網絡；（2）慢生根瘤菌對花生的侵染，篩選能夠穩定標記慢生根瘤菌的質粒，結合激光共聚焦顯微鏡觀察技術檢測慢生根瘤菌在花生根部的侵染路徑。此外，根據已知豆科植物共生信號通路蛋白的編碼基因在花生基因組中篩選出相應的同源基因，通過基因編輯方法敲除花生植株中的這些基因并驗證功能，找到共生過程所涉及的花生共生信號通路；（3）花生根瘤數調節，為了深入了解慢生根瘤菌調控花生根瘤數的機制，首先需要分析慢生根瘤菌結瘤和固氮基因與花生根瘤數的表型關系，隨后通過轉錄組測定方法確定這些基因或蛋白與花生根瘤數調控蛋白的互作機制，找到慢生根瘤菌與花生根瘤數間的調節通路；（4）合成根際微生物菌劑代替單一根瘤菌菌劑，由于單一種屬的根瘤菌在施入土壤后可能被土著微生物同化或抑制，造成菌劑的田間效果不佳。因此，通過合成微生物群落的方法，將根瘤菌及花生根際主要促生微生物按照一定比例混合制成菌劑，能夠提高有益微生物在土壤中的存活率及根際定殖率，達到促進花生結瘤固氮和生長的目的；（5）了解田間花生根瘤的固氮動態，合理配施化學氮肥，在充分利用生物固氮的基礎上減少化學氮肥施用量；（6）基于花生基因組學信息，利用遺傳育種方法，對花生的結瘤相關基因進行遺傳操作，提高主流花生品種的結瘤固氮能力。

5 結語

花生是重要的油料、蛋白質和經濟來源。深入了解花生的慢生根瘤菌結瘤和固氮基因功能以及慢生根瘤菌和花生共生機制是改善二者間結瘤和固氮效率、提高花生產量和品質的關鍵步驟，關系到化學氮肥充分利用、農業生態可持續發展和食品安全，為誘導非豆科植物結瘤固氮提供可能。此外，由于慢生根瘤菌在進化上的特異性以及與花生在共生模式上的特殊性，通過探索二者間的共生機制可以擴展我們在豆科植物生物學和根際生物學領域的知識。

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Research advances of bradyrhizobia and its symbiotic mechanisms with peanut

WU Yue1, SUI Xinhua2, DAI Liangxiang1, ZHENG Yongmei1, ZHANG Zhimeng1, TIAN Yunyun1, YU Tianyi1, SUN Xuewu1, SUN Qiqi1, MA Dengchao3, WU Zhengfeng1*

1Shandong Peanut Research Institute, Qingdao 266100, Shandong;2College of Biological Sciences, China Agricultural University, Beijing 100193;3Jining Academy of Agricultural Sciences, Jining 272009, Shandong

Nitrogen is one of the essential elements for plant growth, which is obtained by legumes through symbiotic nitrogen fixation with rhizobia.The establishment of symbiotic relationship includes nodulation and nitrogen fixation, involving complex regulatory mechanisms, which is also significantly affected by environmental factors.Symbiosis between peanut and bradyrhizobia is essential for peanut growth and production, but contains many specific and unknown symbiotic mechanisms.In this review, symbiosis between peanut bradyrhizobia and peanut was reviewed, including: (1) Diversity and genomic functions of peanut bradyrhizobia; (2) Symbiotic mechanisms between peanut and bradyrhizobia: rhizobial crack infection and symbiotic signal exchange with peanut, peanut nodulation, nitrogen fixation, and nodule number regulation mechanisms; (3) Effects of environmental factors (soil nitrogen, pH, temperature and water content) on peanut nodulation, nitrogen fixation and yield.This review pointed out current problems in peanut bradyrhizobia, symbiosis between peanut and bradyrhizobia, and peanut field application, including few studies on genome functions of peanut bradyrhizobia, unknown interaction mechanisms between bradyrhizobia and peanut in details, as well as, poor utilization rate of peanut bradyrhizobia in the field, etc.Based on this analysis, the future researches should focus on genome omics analysis and gene functional analysis of peanut bradyrhizobia; signal communication pathways, nodule number regulation mechanisms, nutrient exchange systems between bradyrhizobia and peanut; rational application systems of nitrogen fertilizer that match with nodule nitrogen fixation rules, and obtain new peanut bradyrhizobia agents for peanut planting through synthetic biology.This article provided the theoretical basis for further understanding the symbiotic mechanisms of legumes and rhizobia, improving nodulation and nitrogen fixation efficiency of legume crops, reducing chemical nitrogen application, and improving agricultural ecological environment.

bradyrhizobia; peanut; symbiotic nitrogen fixation; mechanism of nodulation and nitrogen fixation; diversity; environmental factor

2021-07-14；

2021-10-09

國家重點研發計劃（2018YFD1000906）、山東省農業科學院農業科技創新工程（CXGC2021B33）、山東省農業科學院農業科技創新工程（CXGC2021A05）、現代農業產業技術體系建設專項（CARS-13）、山東省重大科技創新工程（2019JZZY010702）、山東省花生產業技術體系濟寧綜合試驗站（SDAIT-04-12）

吳月，E-mail：wuyuesw@163.com。通信作者吳正鋒，E-mail：wzf326@126.com

（責任編輯 楊鑫浩）