利用基因工程獲取紅色熒光大腸桿菌*

孫 娟 王思睿

（北京市第五十七中學 北京 100038）

高中生物學教材涉及大量實驗，例如，在生物學選修1 中有微生物的實驗室培養、微生物的分離與計數[1]等，在選修3 中有基因工程實驗等內容。教材中大部分實驗操作都是孤立存在的，更多的是展示一個特定實驗的開展和完成過程，但在解決實際問題時，學生往往缺乏將所學習的實驗內容融會貫通地組合應用，并設計一個完整實驗的相關訓練。

通過學習，學生可掌握實驗技巧，卻難以深刻理解每個實驗在科研工作中的實際應用。因此，本實驗的設計旨在使學生在一個較為完整的實驗過程中融會貫通地應用所學知識。本實驗將選修1、選修3 中的相關實驗進行融合，通過將紅色熒光基因（Cherry）轉入大腸桿菌的科學實踐活動，促進學生領悟在實驗中系統地應用教材知識，從而進一步拓展學生的視野、提高學生的學習興趣和動手能力，在活動中提升學生的生物學學科核心素養。

1 實驗原理

質粒是一種結構簡單，存在于細菌擬核DNA之外，具有自我復制能力的小型環狀DNA 分子[2]。利用質粒作為基因工程的載體，能有效將外源基因轉入細胞。可通過PCR 等技術獲得目的基因，利用限制酶和DNA 連接酶可將目的基因連入質粒中，構建重組質粒。

經Ca2+處理后的大腸桿菌感受態細胞能吸收周圍環境中的DNA 分子，利用熱激法可將重組質粒導入感受態細胞。目的基因隨著重組質粒進入受體細胞，并在受體細胞內維持穩定和表達的過程稱為轉化[3]。

本實驗采用的質粒含有氨芐青霉素抗性基因，轉化成功的大腸桿菌能在含有氨芐青霉素的LB 培養基中存活，并且目的基因可表達出紅色熒光蛋白，以上2 點均為篩選轉化成功大腸桿菌的依據。

2 實驗儀器和材料

儀器與耗材：恒溫水浴鍋、超凈工作臺、高壓滅菌鍋、恒溫培養箱、移液器、電子秤、錐形瓶、酒精燈、藥匙、1.5 mL EP 管等。

材料與試劑：含有紅色熒光基因的重組質粒、大腸桿菌JM109 感受態細胞（此感受態轉化效率高，且常用于目的基因的表達）、瓊脂、NaCl、酵母粉、蛋白胨、氨芐青霉素等。

3 實驗過程

3.1 制備培養基

1）稱量：稱取蛋白胨10 g、酵母膏5 g、NaCl 10 g。

2）熔化：將稱量好的蛋白胨、酵母膏和NaCl 加入燒杯中，用玻璃棒攪拌，使其溶解。加入瓊脂，加熱使其熔化。當瓊脂完全熔化后，補加蒸餾水至1 000 mL。液體培養基不加入瓊脂（同時制備不含瓊脂的液體培養基用于細菌的培養的保存）。

3）滅菌：將配制好的培養基轉移至錐形瓶中，封口，并用皮筋勒緊，再置于高壓蒸汽滅菌鍋內，121℃，滅菌20～30 min。

4）倒平板：待培養基冷卻至50℃左右時，在酒精燈火焰附近倒平板。其中，一部分培養基添加氨芐青霉素，使其終濃度為100 μg/mL，制備抗性平板培養基。

3.2 大腸桿菌的轉化

1）將100 μL 感受態細胞置于冰上融化。

2）向感受態細胞懸液中加入10 μL 帶有紅色熒光基因的重組質粒，輕輕旋轉離心管以混勻內容物，冰上放置30 min。

3）將離心管置于42℃水浴鍋中放置90 s，然后快速轉移至冰中放置2～3 min，注意不要搖動離心管。

4）向離心管中加入500 μL 無菌、無抗性的LB培養基，37℃、180 r/min 振蕩培養1 h。目的是使質粒上相關的抗性標記基因表達，使菌體復蘇。

3.3 涂布平板

1）取適量已轉化的感受態細胞菌液，滴加至含氨芐青霉素的LB 培養基表面。涂布用量可根據具體實驗進行調整，例如，轉化的DNA 總量較多，可取100 μL 左右轉化產物涂板；反之，如果轉化的DNA 總量較少，可取200～300 μL 的轉化產物涂板。

2）將涂布器在火焰上灼燒，冷卻。

3）用涂布器將菌液均勻地涂布在培養基表面，使菌液分布均勻。

4）涂布剩余的菌液4℃保存。如果次日的轉化菌落數過少，可將剩余的菌液再涂布新的平板。

3.4 過夜培養 將涂布完的平板倒置于恒溫培養箱內，在37℃的條件下培養24 h。

3.5 篩選與純化

1）培養12 h 后，觀察菌落的形態和顏色；如果沒有紅色菌落，則繼續培養24～36 h，挑選出培養基上紅色的菌落。

圖1 轉化成功后的紅色菌落（方框內所示）

2）用滅菌的牙簽挑取紅色菌落，在LB 培養基上通過平板劃線法純化紅色大腸桿菌，以上操作皆在酒精燈火焰旁完成，接種環在接觸菌液和每次劃線前都要在酒精燈上灼燒。

3）第1 次劃線完成后培養24 h，挑選出紅色基因表現最明顯的菌落再進行培養。劃線操作可重復多次以達到純化目的。

圖2 平板劃線法純化獲得的紅色大腸桿菌菌落

4）將最后得到的純化過的紅色大腸桿菌冷凍保存在含有30%甘油的LB 液體培養基中。

3.6 課時安排建議 本實踐活動可分3 課時完成。第1 課時，學生可學習培養基的配制、滅菌技術、倒平板等操作；第2 課時，學生可完成細菌的轉化實驗、稀釋涂布等操作；第3 課時，學生可完成轉化細菌的篩選和鑒定，并作進一步的分離純化（平板劃線法）。有條件的情況下，還可進一步擴大培養紅色熒光細菌，并提取其中含有紅色熒光基因的重組質粒。

每節實踐活動都以“理論+實踐”的模式進行，以理論指導實踐，以實踐驗證理論，在探索活動中促進學生全面學習。

4 結果與討論

本實驗將教材中零散的實驗知識整合，使學生對所學實驗知識在實際科研中的應用有了更加具體、清晰地認識，體驗較系統、完整的實驗操作流程。在支架式教學理念中，每個實驗的學習都是按“最近發展區”的要求建立基礎概念的過程，通過創建“獲取紅色熒光細菌”的情境，學生可在獨立探索和協作學習中，更好地體會、領悟各小實驗在大實驗流程中的價值，在實驗開展和結束后不斷進行效果評價，并針對出現的問題加以解決，從而促進知識的學習和能力的提升。

通過實踐發現，大腸桿菌轉化實驗對于中學生難度并不大，學生能在不占用太多課余時間的情況下完成實驗。學生親身體驗實驗過程有助于提升學生學習生物學的興趣、培養學生的生物學學科核心素養。學生自己設計實驗方案、動手操作也培養了學生的動手能力和解決問題的能力[4]。本實驗由于條件受限，直接采購了含有Cherry基因的質粒，希望在將來能將DNA 的提取、質粒的提取、PCR 和瓊脂糖凝膠電泳等實驗過程都加入其中，使學生能感受更加完整、系統的實驗。