響應(yīng)面優(yōu)化植物乳桿菌發(fā)酵番茄汁工藝及其品質(zhì)評(píng)估

劉 暢，左常洲，彭 菁, ，陳繼昆，屠 康，潘磊慶,

（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，江蘇南京 210095；2.云南省綠色食品發(fā)展中心，云南昆明 650225）

番茄（Solanum lycopersicum），即西紅柿，原產(chǎn)于南美洲，目前在中國(guó)大部分區(qū)域均有種植。番茄營(yíng)養(yǎng)豐富，風(fēng)味獨(dú)特，口感酸甜[1]。此外，番茄含有豐富的果膠、蘋果酸、檸檬酸、番茄紅素、β-胡蘿卜素、多酚及黃酮等活性物質(zhì)[2]，具有降血脂[3]、助消化[4]、提高人體免疫力[5]、抗衰老和抗癌等功能[6]，因此深受消費(fèi)者喜愛。然而，新鮮番茄含水量高、采后呼吸作用強(qiáng)烈，極易發(fā)生腐爛，導(dǎo)致其貨架期較短，造成了很大的經(jīng)濟(jì)損失[7]。近年來，隨著我國(guó)果蔬深加工技術(shù)的發(fā)展，番茄制品種類日益繁多，有效推動(dòng)了番茄產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，實(shí)現(xiàn)了采后減損增值。

目前，市場(chǎng)上常見的番茄制品主要包括番茄原汁和番茄調(diào)味料等。近年來，發(fā)酵型乳酸飲品由于其獨(dú)特的風(fēng)味，豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，深受消費(fèi)者喜愛。因此，新型發(fā)酵番茄果汁品種日益增多。例如，杜冰等利用嗜酸乳桿菌發(fā)酵番茄汁，生產(chǎn)了一種新型功能飲料[8]。李鵬程等利用植物乳桿菌和干酪乳桿菌，發(fā)明了一種西瓜-番茄復(fù)合果蔬汁[9]。這些番茄發(fā)酵飲品在保留番茄原汁營(yíng)養(yǎng)成分的同時(shí)，還增加了對(duì)人體有益的多種氨基酸成分，提高了番茄飲料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。

植物乳桿菌因其對(duì)植物性發(fā)酵基質(zhì)的顯著適應(yīng)性和轉(zhuǎn)化酚類物質(zhì)的優(yōu)勢(shì)被廣泛應(yīng)用于果蔬的發(fā)酵過程，如蔬菜汁的發(fā)酵[10]、泡菜的制備[11]和葡萄酒的蘋果酸-乳酸發(fā)酵[12]等。在發(fā)酵過程中，植物乳桿菌能夠通過其增殖代謝過程，改善果蔬汁的成分組成，從而起到改善果蔬汁風(fēng)味[13]、延緩果蔬汁品質(zhì)敗壞[14]及增加果蔬汁的保健功能[15]等作用。目前，多項(xiàng)研究證明植物乳桿菌（BNCC337796）具有較好的發(fā)酵功能。在銀杏果發(fā)酵果汁的研究中發(fā)現(xiàn)，該菌具有良好的生長(zhǎng)和產(chǎn)酸性能，有效改變了果汁中游離氨基酸的含量，豐富了銀杏果果汁的風(fēng)味；同時(shí)，它能降低果汁中銀杏酸的含量，豐富萜烯內(nèi)酯，代謝果汁中的酚類物質(zhì)[16]。植物乳桿菌在發(fā)酵甘藍(lán)汁液的過程中降解硫代葡萄糖苷，從而增強(qiáng)其活性[17]。然而，植物乳桿菌對(duì)于番茄汁的發(fā)酵作用尚不明確。

因此，本文擬通過單因素及響應(yīng)面試驗(yàn)確定植物乳桿菌發(fā)酵番茄汁的最佳工藝條件，探究發(fā)酵對(duì)番茄汁中微生物代謝主要指標(biāo)（pH、活菌數(shù)、總酸及總糖含量）、主要活性成分（番茄紅素、β-胡蘿卜素、總酚、總黃酮）以及抗氧化活性的影響，在此基礎(chǔ)上評(píng)估發(fā)酵番茄汁經(jīng)低溫貯藏后的品質(zhì)，以期為植物乳桿菌發(fā)酵番茄汁的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

番茄（普羅旺斯） 購(gòu)買自山東濰坊，新鮮采摘后，在低溫條件下，迅速運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室；植物乳桿菌（BNCC337796）凍干粉 北京北納生物保藏中心；MRS肉湯、MRS瓊脂 上海盛思生化科技有限公司；氯化鈉（分析純） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；抗壞血酸（分析純） 上海源葉生物科技有限公司；羧甲基纖維素鈉（食品級(jí)）、海藻酸丙二醇酯（食品級(jí)） 泰昌技術(shù)有限公司；黃原膠、瓊脂、果膠及卡拉膠（均為食品級(jí)） 泰昌技術(shù)有限公司；蔗糖（食品級(jí)）、碳酸鈉（分析純） 南京壽德生物科技有限公司。

WYT-J糖度計(jì) 成都豪創(chuàng)光電儀器有限公司；MJ-BL25B2攪拌機(jī) 廣東美的生活電器制造有限公司；LDZF-50KB型立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；SW-CJ-1FD型單人單面凈化工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司；PYX-DHS.500BS型隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；榨汁機(jī) 九陽股份有限公司；UV-1800型紫外分光光度計(jì) 日本島津公司；3K15型冷凍離心機(jī) 德國(guó)Sigma公司；JA2003型電子天平 上海精密科學(xué)儀器有限公司；HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋 國(guó)華電器有限公司；CTHI-250B型恒溫恒濕箱 美國(guó)施都凱設(shè)備公司；CR-13型便攜式色差計(jì) 日本柯尼卡美能達(dá)公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌種制備 植物乳桿菌（BNCC337796）凍干粉混勻在MRS肉湯中經(jīng)37 ℃活化24 h后，與50%的甘油按照1:1混合，于?20 ℃下長(zhǎng)期保存。另取培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接到斜面培養(yǎng)基上，37 ℃下培養(yǎng)24 h后放置于4 ℃下短期保存，作為整個(gè)研究中的種子液制備菌種。挑取斜面菌落接種于50 mL無菌MRS肉湯中，37℃培養(yǎng)24 h后作為活化的種子液使用。通過稀釋平板計(jì)數(shù)法，計(jì)算得到活菌數(shù)濃度約為1.5×109CFU/mL。

1.2.2 番茄汁制備 選取無病蟲害、顏色鮮紅均勻、大小適中的番茄，用清水沖洗去表面污垢，去果蒂，在90 ℃清水中燙漂3 min并去皮。四分法切開番茄，經(jīng)榨汁機(jī)榨汁后用四層紗布過濾。用飽和Na2CO3溶液調(diào)節(jié)番茄汁的pH至6.5（生番茄汁pH在4.3～4.4之間，植物乳桿菌的適宜生長(zhǎng)pH為6.5左右），調(diào)節(jié)可溶性固形物含量到12°Brix。用恒溫水浴鍋將番茄汁中心溫度加熱到80 ℃并保持15 s殺菌，冷卻待用。

1.2.3 番茄汁發(fā)酵工藝

1.2.3.1 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 分別以接種量、發(fā)酵時(shí)間和發(fā)酵溫度作為發(fā)酵工藝過程中的單因素，以活菌數(shù)及總酸含量為指標(biāo)進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。其中，固定接種量2%、發(fā)酵時(shí)間24 h，考察發(fā)酵溫度（32、36、40和44 ℃）對(duì)活菌數(shù)和總酸的影響；固定發(fā)酵時(shí)間24 h、發(fā)酵溫度36 ℃，考察接種量（1%、2%、3%和4%）對(duì)活菌數(shù)和總酸的影響；固定接種量2%、發(fā)酵溫度36 ℃，考察發(fā)酵時(shí)間（20、24、28和32 h）對(duì)活菌數(shù)和總酸的影響。

1.2.3.2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以感官整體喜好度為響應(yīng)值，對(duì)植物乳桿菌發(fā)酵番茄汁影響顯著的3個(gè)因素，發(fā)酵溫度（34、36和38 ℃）、植物乳桿菌接種量（1%、2%和3%）和發(fā)酵時(shí)間（24、28和32 h）為試驗(yàn)因素，利用Design-expert 8.0.5分析軟件Box-Behnken進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)（表1）。

研究性學(xué)習(xí)，廣義上泛指學(xué)生主動(dòng)探究問題的學(xué)習(xí)，也就是說，它只是一種學(xué)習(xí)方式。從狹義理解，研究性學(xué)習(xí)是指學(xué)生在教師的指導(dǎo)下，從自身生活和社會(huì)生活中選擇和確定選題，以類似科學(xué)研究的方式主動(dòng)地獲取知識(shí)、應(yīng)用知識(shí)、解決問題。在這里，研究性學(xué)習(xí)是指一門獨(dú)立的課程。通常我們說的研究性學(xué)習(xí)，是指狹義，國(guó)際上通稱為PBL課程。

表1 番茄汁發(fā)酵工藝優(yōu)化Box-Behnken試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken test for the optimization of tomato juice fermentation process

1.2.4 感官評(píng)價(jià) 感官評(píng)價(jià)參考盧嘉懿等[18]采用“雙盲法”：由10個(gè)食品專業(yè)學(xué)生（男女各5人）組成感官評(píng)價(jià)小組，對(duì)發(fā)酵番茄汁飲料的“色、香、味、形”四個(gè)方面進(jìn)行打分，除去最高和最低評(píng)分，其余結(jié)果取平均值，得到感官評(píng)分。感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)見表2。

表2 感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory evaluation standards

1.2.5 發(fā)酵過程中番茄汁指標(biāo)變化 接種量為2%的番茄汁在37 ℃下發(fā)酵，每隔6、12、30和48 h 取樣測(cè)定發(fā)酵過程中活菌數(shù)、pH、總酸及總糖含量的變化。其中，活菌數(shù)的測(cè)定參照GB 4789.35-2010；總酸的測(cè)定參考GB/T 12456-2008；可溶性固形物采用手持糖度儀進(jìn)行測(cè)定；pH采用pH計(jì)進(jìn)行測(cè)定；總糖含量采用蒽酮比色法測(cè)定[19]。

1.2.6 發(fā)酵番茄汁活性分析及品質(zhì)評(píng)估 經(jīng)步驟1.2.3獲得番茄汁的最佳發(fā)酵條件后，測(cè)量經(jīng)最佳工藝條件發(fā)酵前后番茄汁中番茄紅素、β-胡蘿卜素及抗氧化活性的變化。番茄紅素的測(cè)定參照NYT1651-2008；β-胡蘿卜素的測(cè)定參照GB 5009.83-2016采用高效液相色譜法；VC含量測(cè)定采用鉬藍(lán)比色法[20]；多酚含量的測(cè)定采用福林酚比色法[21]；黃酮的測(cè)量方法采用氯化鋁比色法[22]；DPPH自由基清除能力和ABTS+自由基清除能力測(cè)定參照郝玉潔[23]的方法；羥自由基清除率和超氧自由基清除能力測(cè)定參照Li等[24]的方法。

經(jīng)最佳工藝發(fā)酵后的番茄汁灌裝于250 mL玻璃瓶中（每瓶200 mL），置于4 ℃下貯藏21 d。根據(jù)輕工業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)QBT 5356-2018對(duì)最終產(chǎn)品進(jìn)行感官指標(biāo)、理化指標(biāo)和微生物指標(biāo)的檢測(cè)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Design-Expert.8.05 軟件進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)和方差分析，Origin 2018軟件進(jìn)行繪圖，SPSS 20.0進(jìn)行方差分析，差異顯著性水平為0.05。每組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵工藝優(yōu)化

2.1.1 發(fā)酵溫度單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果 溫度對(duì)番茄汁發(fā)酵的影響如圖1所示。在32 ℃時(shí)，活菌數(shù)為9.36 log（CFU/mL），總酸含量為0.58%；在36 ℃時(shí)，活菌數(shù)增長(zhǎng)到9.43 log（CFU/mL），總酸增長(zhǎng)到0.66%。可以發(fā)現(xiàn)，隨著溫度的升高，番茄汁的活菌數(shù)和總酸量顯著上升（P<0.05）。這可能是由于溫度的上升導(dǎo)致了植物乳桿菌的活力升高，繁殖和產(chǎn)酸速率增快[25]。然而，在溫度40 ℃時(shí)，發(fā)酵番茄汁的活菌數(shù)和總酸分別為9.38 log（CFU/mL）和0.6%，與32和36 ℃時(shí)相比稍有下降；發(fā)酵溫度為44 ℃時(shí)，發(fā)酵番茄汁的活菌數(shù)為9.25 log（CFU/mL），總酸含量為0.47%，相比于40 ℃時(shí)，活菌數(shù)和總酸量顯著下降（P<0.05），原因是發(fā)酵溫度會(huì)對(duì)菌體內(nèi)的蛋白質(zhì)、酶活性產(chǎn)生直接影響。發(fā)酵溫度過高會(huì)使菌體細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)發(fā)生變性，影響菌體核糖體、RNA等大分子的穩(wěn)定性，抑制菌體生長(zhǎng)，從而導(dǎo)致活菌數(shù)和產(chǎn)酸量下降；而溫度低時(shí)活菌數(shù)和總酸含量少，是由于發(fā)酵溫度過低會(huì)降低酶的活力，引起細(xì)胞膜流動(dòng)性變化，進(jìn)而影響菌體的正常生長(zhǎng)[26]。根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可以看出植物乳桿菌在32～40 ℃范圍內(nèi)在番茄汁中生長(zhǎng)和產(chǎn)酸比較適宜，故選擇34、36和38 ℃進(jìn)行下一步的響應(yīng)面試驗(yàn)。

圖1 發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵番茄汁活菌數(shù)和總酸的影響Fig.1 Effect of fermentation temperature on the total viable count and total acid in fermented tomato juice

2.1.2 接種量單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果 接種量對(duì)番茄汁發(fā)酵的影響如圖2所示。當(dāng)接種量為1%時(shí)，發(fā)酵后番茄汁中的活菌數(shù)為9.34 log（CFU/mL），總酸含量為0.53%；當(dāng)接種量為2%時(shí)，發(fā)酵后番茄汁中的活菌數(shù)為9.44 log（CFU/mL），總酸含量為0.68%。隨著初始接種量從1%升到2%，番茄汁發(fā)酵后的活菌數(shù)和總酸均顯著提高（P<0.05）。當(dāng)接種量升到3%時(shí)，發(fā)酵后番茄汁中的活菌數(shù)分別為9.49 log（CFU/mL），總酸為0.62%，活菌數(shù)提高，產(chǎn)酸量變化不顯著。當(dāng)接種量為4%時(shí)，發(fā)酵后番茄汁中的活菌數(shù)為9.54 log（CFU/mL），總酸量為0.48%，活菌數(shù)顯著增加（P<0.05），總酸卻顯著減小（P<0.05）。推測(cè)是由于接種量過大時(shí)，植物乳桿菌在營(yíng)養(yǎng)充足的情況下大量生長(zhǎng)繁殖，發(fā)酵產(chǎn)酸速率快，發(fā)酵時(shí)間縮短，但由于有一部分營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)會(huì)被用于菌種生長(zhǎng)繁殖，在等量營(yíng)養(yǎng)成分情況下，用于發(fā)酵產(chǎn)生營(yíng)養(yǎng)成分的量就會(huì)相應(yīng)減少，進(jìn)而導(dǎo)致產(chǎn)酸量會(huì)下降。同理，接種量小，菌種初始基數(shù)小，產(chǎn)酸速率較慢，此時(shí)用于菌種生長(zhǎng)繁殖的營(yíng)養(yǎng)成分會(huì)變少，用于發(fā)酵產(chǎn)酸的成分量就會(huì)相應(yīng)增加。但初始接種量過少導(dǎo)致的速率過慢也會(huì)導(dǎo)致在相同時(shí)間內(nèi)產(chǎn)酸量過少，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)未被充分利用，導(dǎo)致發(fā)酵不充分[27]。綜合結(jié)果來看，接種量為1%和4%時(shí)相應(yīng)的總酸無顯著變化（P>0.05），考慮成本問題，選擇1%的接種量。最后選擇1%、2%、3%接種量進(jìn)行下一步的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

圖2 接種量對(duì)發(fā)酵番茄汁活菌數(shù)和總酸的影響Fig.2 Effect of inoculation amount on the total viable count and total acid in fermented tomato juice

圖3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵番茄汁活菌數(shù)和總酸的影響Fig.3 Effect of fermentation time on the total viable count and total acid in fermented tomato juice

2.1.4 發(fā)酵工藝響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn) 運(yùn)用Design expert V8.0b軟件對(duì)表3中感官整體喜好度進(jìn)行擬合，得到回歸方程為Y=86.26+1.64A-0.94B+0.85C+0.26AB+0.45AC?0.11BC?2A2?5.87B2?0.72C2，對(duì)上述回歸方程進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表4。

表3 番茄汁發(fā)酵工藝優(yōu)化Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of Box-Behnken test for optimizing tomato juice fermentation process

由表4方差分析可知，所建模型差異極顯著（P<0.0001），表明本次模型建立有意義；失擬項(xiàng)P=0.0968>0.05，說明模型具有較高的可靠性；F值為31.23，表明二次模型高度顯著，因變量和自變量之間的線性關(guān)系極顯著（R2=0.98）；方差分析的結(jié)果表明，3種因素對(duì)發(fā)酵番茄汁的影響主次順序?yàn)锳>B>C，即發(fā)酵溫度>接種量>發(fā)酵時(shí)間。其中，一次項(xiàng)A對(duì)結(jié)果影響極顯著（P<0.01），B和C對(duì)結(jié)果影響顯著（P<0.05）；交互項(xiàng)對(duì)結(jié)果影響不顯著（P>0.05），二次項(xiàng)A2和B2對(duì)結(jié)果影響極顯著（P<0.01），C2對(duì)結(jié)果影響不顯著（P>0.05）。

表4 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 4 Analysis of variance of response surface test

響應(yīng)面曲面（等高線圖和3D圖）可直觀反映試驗(yàn)中不同因素以及兩兩因素之間交互作用對(duì)發(fā)酵番茄汁感官評(píng)分的影響：等高線的橢圓程度表示兩兩因素之間交互作用對(duì)發(fā)酵番茄汁感官評(píng)分影響的顯著性，橢圓程度越大則影響越顯著；響應(yīng)面的坡度顯示試驗(yàn)因素對(duì)感官評(píng)分的影響，坡度越大則影響越大。溫度、接種量、發(fā)酵時(shí)間兩兩交互作用對(duì)發(fā)酵番茄汁整體感官喜好度影響的響應(yīng)面曲線及等高線如圖4所示。在發(fā)酵溫度34～38 ℃和接種量1%～3%范圍內(nèi)，當(dāng)發(fā)酵溫度一定，產(chǎn)品的感官整體喜好度隨接種量的升高呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)；在發(fā)酵溫度34～38 ℃和發(fā)酵時(shí)間24～32 h范圍內(nèi)，當(dāng)發(fā)酵溫度一定，產(chǎn)品的感官評(píng)分隨發(fā)酵時(shí)間的增加而上升；當(dāng)接種量為1%～3%，發(fā)酵時(shí)間為24～32 h時(shí)，接種量一定，產(chǎn)品的感官評(píng)分隨發(fā)酵時(shí)間的增加而上升。由圖4的3D曲面平滑程度可知，發(fā)酵溫度和接種量、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時(shí)間以及接種量和發(fā)酵時(shí)間兩兩因素的交互作用不明顯，這與方差分析結(jié)果相一致。

圖4 各因素交互作用對(duì)發(fā)酵番茄汁感官評(píng)價(jià)影響的響應(yīng)面和等高線Fig.4 Response surface and contour lines of the interaction of various factors on the sensory evaluation of fermented tomato juice

利用Design Expert 8.0.5軟件對(duì)所得回歸方程進(jìn)行逐步回歸，確定最佳發(fā)酵工藝參數(shù)為發(fā)酵溫度36.98 ℃、菌種接種量1.92%、發(fā)酵時(shí)間30.01 h，此時(shí)發(fā)酵番茄汁感官得分預(yù)測(cè)值為88.14分。為了便于實(shí)際操作，將最佳發(fā)酵工藝參數(shù)修改為發(fā)酵溫度37 ℃、菌種接種量2%、發(fā)酵時(shí)間30 h，在此最優(yōu)發(fā)酵工藝條件下，發(fā)酵番茄汁的感官得分為87.69分，與模型預(yù)測(cè)值（88.14分）較一致，從而驗(yàn)證了模型的可靠性。因此，最后選擇發(fā)酵溫度37 ℃、菌種接種量2%、發(fā)酵時(shí)間30 h作為植物乳桿菌發(fā)酵番茄汁的最佳工藝條件。

2.2 發(fā)酵過程中番茄汁pH、活菌數(shù)、總酸及總糖含量的變化

pH、活菌數(shù)、總酸及總糖含量是判斷微生物代謝變化的重要指標(biāo)，對(duì)發(fā)酵產(chǎn)品的風(fēng)味以及發(fā)酵體系中微生物的存活與代謝產(chǎn)物的積累具有重要的影響作用，同時(shí)也會(huì)影響產(chǎn)品的貨架期，是影響發(fā)酵果蔬汁品質(zhì)的重要指標(biāo)[28]。由圖5可以看出，在2%接種量，37 ℃的條件進(jìn)行發(fā)酵時(shí)，在開始的0～6 h內(nèi)，活菌數(shù)由7.48 log（CFU/mL）增長(zhǎng)到7.76 log（CFU/mL）。同時(shí)，由于在發(fā)酵過程中，植物乳桿菌消耗糖分并進(jìn)行產(chǎn)酸，導(dǎo)致pH由6.5下降至4.83，總糖含量由11.23%下降至10.83%，該時(shí)期處于延滯期，因此菌種增殖和產(chǎn)酸速率比較緩慢。在6～12 h內(nèi)，菌種生長(zhǎng)達(dá)到對(duì)數(shù)期，此時(shí)菌種增殖速度與產(chǎn)酸速率加快，活菌數(shù)由7.76 log（CFU/mL）顯著增長(zhǎng)至8.70 log（CFU/mL） （P<0.05），總酸含量由0.21%上升到0.44%，總糖含量則由10.83%下降至10.02%。在12～30 h內(nèi)，菌種增殖速度開始放緩，但總酸進(jìn)一步積累，發(fā)酵30 h時(shí)總酸含量達(dá)到0.75%，總糖含量為8.52%，糖酸比由開始發(fā)酵時(shí)的74.9降至11.4，活菌數(shù)在此時(shí)達(dá)到最高值，為9.45 log（CFU/mL）。在30～48 h內(nèi)，發(fā)酵進(jìn)入穩(wěn)定期，由于代謝物質(zhì)的積累和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消耗，活菌數(shù)基本未發(fā)生變化，處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，產(chǎn)酸量則繼續(xù)增加，發(fā)酵48 h時(shí)總酸量達(dá)到1.12%，總糖顯著下降至6.86%（P<0.05），此時(shí)的糖酸比為6.13，番茄汁酸度過大，影響其正常口感。因此，綜合不同發(fā)酵期間的pH、活菌數(shù)、總酸及總糖含量來看，發(fā)酵30 h的番茄汁品質(zhì)最佳同時(shí)保持了良好的口感，故在該時(shí)期停止主發(fā)酵進(jìn)入貯藏階段。

圖5 發(fā)酵過程中pH和活菌數(shù)的變化（a）以及總酸和總糖含量的變化（b）Fig.5 Changes of pH and total viable count （a） and total acid and total sugar content （b） during fermentation

2.3 發(fā)酵前后番茄汁中番茄紅素、β-胡蘿卜素及抗氧化活性的變化

番茄紅素在高溫中不穩(wěn)定，易氧化降解[29]。由表5可知，在經(jīng)過植物乳桿菌發(fā)酵30 h后，番茄汁中番茄紅素的含量由19.9 μg/mL下降至12.8 μg/mL。此外，β-胡蘿卜素含量從2.62 μg/mL降至1.82 μg/mL，發(fā)酵過程中的損失率與加工番茄汁的過程相當(dāng)。發(fā)酵番茄汁中的總酚及總黃酮含量經(jīng)過發(fā)酵后均顯著提高（P<0.05），前者含量由1.26 g/L升高至2.81 g/L，后者從1.07 g/L提高到1.35 g/L。這與郭小等[30]的研究結(jié)果相一致，甌柑汁經(jīng)植物乳桿菌發(fā)酵后總黃酮含量顯著升高（P<0.05）。乳酸菌可以通過分泌糖苷酶，將不溶性的膳食纖維結(jié)合的黃酮釋放形成水溶性黃酮，從而導(dǎo)致總黃酮含量上升[31]。此外，在發(fā)酵過程中VC含量從0.75 g/L降至0.35 g/L。這是由于VC的分子結(jié)構(gòu)中含有連烯二醇的結(jié)構(gòu)，性質(zhì)極其不穩(wěn)定，溫度、濕度、壓力、摩擦、微量元素及光和酸等都可以導(dǎo)致其發(fā)生分解[32]。

表5 發(fā)酵前后番茄汁中番茄紅素、β-胡蘿卜素含量及抗氧化活性的變化Table 5 Changes of lycopene, β-carotene content and antioxidant capacity of tomato juice before and after fermentation

DPPH清除力的高低反應(yīng)了果汁等食品的抗氧化能力強(qiáng)弱，番茄汁中的總酚、VC和其他一些還原性強(qiáng)的物質(zhì)都具有清除DPPH的能力。表5結(jié)果顯示發(fā)酵后的番茄汁DPPH清除率及ABTS+自由基清除率均顯著提高（P<0.05），前者由47.69%達(dá)到了77.06%，是發(fā)酵前的1.62倍；后者由27.62%升至34.77%。根據(jù)Shahidi等[33]的報(bào)道，DPPH自由基清除能力與酚類物質(zhì)密切相關(guān)；亦有研究報(bào)道酚類物質(zhì)具有多羥基結(jié)構(gòu)可使自由基向其穩(wěn)定態(tài)轉(zhuǎn)變，高濃度的酚類物質(zhì)具有較高的ABTS+自由基清除能力[34?35]。因此，發(fā)酵過程中番茄汁總酚含量的顯著提高可能是導(dǎo)致其DPPH自由基及ABTS+自由基清除能力提高的重要原因。

發(fā)酵前后番茄汁的超氧自由基清除率由86.39%降至45.67%，這與Gao等[36]的研究結(jié)果相一致，植物乳桿菌發(fā)酵會(huì)導(dǎo)致苦瓜汁的超氧自由基清除率降低。高溫處理會(huì)導(dǎo)致超氧自由基結(jié)合態(tài)變成游離態(tài)，導(dǎo)致檢測(cè)含量上升，最終表現(xiàn)為超氧自由基清除率顯著下降（P<0.05）。此外，發(fā)酵前后番茄汁的羥自由基清除率由99.16%變化為98.39%，差異并不顯著（P>0.05）。可推測(cè)發(fā)酵過程對(duì)番茄汁的羥自由基清除能力無顯著影響。

2.4 產(chǎn)品品質(zhì)評(píng)估

發(fā)酵番茄汁經(jīng)低溫（4 ℃）貯藏后的品質(zhì)評(píng)估參考我國(guó)輕工業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)QBT 5356-2018進(jìn)行，其具體結(jié)果見表6。結(jié)果表明低溫貯藏21 d后，產(chǎn)品的各感官指標(biāo)（色澤、香味、口味和形態(tài)）均達(dá)標(biāo)，各理化指標(biāo)（蛋白質(zhì)、總砷、鉛、銅、脲酶試驗(yàn)）和微生物指標(biāo)（乳酸菌、大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌）也符合標(biāo)準(zhǔn)。其中，乳酸菌的含量為3.7×108CFU/mL，遠(yuǎn)超相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的要求（≥1×107CFU/mL）。這表明開發(fā)的這款植物乳桿菌發(fā)酵番茄汁產(chǎn)品在4 ℃下貯藏21 d均能達(dá)到發(fā)酵果蔬汁食用安全性要求，貨架期也滿足巴氏殺菌果蔬飲料的要求。

表6 低溫貯藏后產(chǎn)品的品質(zhì)評(píng)估Table 6 Quality evaluation of fermented tomato juice products after stored at low temperature

3 結(jié)論

本文通過單因素實(shí)驗(yàn)及響應(yīng)面分析獲得了植物乳桿菌發(fā)酵番茄汁的最佳工藝參數(shù)為：發(fā)酵溫度37 ℃、菌種接種量2%、發(fā)酵時(shí)間30 h，此時(shí)發(fā)酵番茄汁的最終感官評(píng)價(jià)得分為87.69分。在發(fā)酵過程中，番茄汁中活菌數(shù)量呈上升趨勢(shì)后趨于穩(wěn)定，總酸含量不斷上升，導(dǎo)致其pH持續(xù)下降；當(dāng)發(fā)酵時(shí)間過長(zhǎng)時(shí)，由于總糖含量的下降導(dǎo)致糖酸比失衡。此外，通過測(cè)定發(fā)酵前后番茄汁的抗氧化活性發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵過程促進(jìn)了番茄汁中總酚和總黃酮的積累，增強(qiáng)了其ABTS和DPPH自由基清除能力，提高了產(chǎn)品的抗氧化能力。然而，在發(fā)酵過程中番茄紅素、β-胡蘿卜素及VC三種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)有一定損失，表明未來在工業(yè)生產(chǎn)中，需要注意及時(shí)補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)或采取新的工藝減少這些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的降解。初步探討了產(chǎn)品的貨架期，對(duì)4 ℃貯藏21 d的產(chǎn)品品質(zhì)評(píng)估表明其各項(xiàng)指標(biāo)能達(dá)到發(fā)酵果蔬汁食用安全性要求，為后期的工業(yè)化生產(chǎn)提供了理論依據(jù)。