超聲輔助低共熔溶劑法提取玉米芯總黃酮工藝優化研究

黎 莉，楊景淇，于德涵，曲 男，孫 悅，徐 喆

（綏化學院食品與制藥工程學院，黑龍江綏化 152061）

玉米芯是玉米脫粒后殘余物，占整個玉米比重的20%～30%。我國是產玉米大國，每年玉米加工后殘余大約7000萬噸玉米芯。目前，關于玉米芯應用研究的報道主要集中在以下四個方面：一是作為工業原料生產木糖醇、糠醛等物質；二是作為培養基料生產食用菌；三是作為飼料；四是經過發酵生產乙醇等生物燃料[1?4]。據統計，現階段我國每年對玉米芯的利用量僅為年產量的15%左右[5]，其余絕大多數都被丟棄或焚燒，不但造成極大浪費，還給環境治理造成很大壓力。

黃酮類化合物是植物細胞內的一類重要次級代謝產物，因其在生物體內能清除自由基而表現出強抗氧化、抗衰老功能[6]；另外黃酮類物質在降血糖、降血脂、抗菌、抗病毒等方面也有很好的功效[7?8]；近年來，還有黃酮化合物抗腫瘤方面的應用見諸報道[9]。

低共熔溶劑（deep eutectic solvents，DES）是由Abboot等[10]于2003年提出的一種新型離子液體類似物，它是由一定比例的氫鍵受體和氫鍵供體組成的低共熔混合物，這種混合物多由兩種或者三種組分組成。DES的理化性質同離子液體類似，但組成較離子液體簡單，易制備、易保存，且成本更低；和傳統有機溶劑相比，DES不揮發、安全無毒性，是一種可生物降解的環境友好型溶劑，生物活性成分在DES中的穩定性較有機溶劑中更高[11]，后續分離、純化也多采用大孔樹脂吸附，操作簡單、成本低廉。目前，DES已經用于如多酚、皂苷、黃酮等多種活性成分的提取[12?14]，而且因其具有的優良特性漸有取代有機試劑、離子液體等常用提取溶劑的趨勢，潛力巨大[15]。

然而，DES雖然在活性物質提取方面表現出了良好的研究價值和前景，但目前DES的應用仍處于“試錯”階段，沒有充分的理論依據和經驗規律可以借鑒。因此，本研究以玉米芯總黃酮高效提取為目標，篩選出組成和組分比例最優的DES作為提取試劑，通過單因素實驗和響應面法優化探索玉米芯總黃酮的最佳提取工藝，旨在為低共熔溶劑在天然產物綠色提取和進一步開發玉米芯資源方面提供數據支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

玉米芯 采集于黑龍江省綏化市北林區，品種為先玉335；蘆丁標準品 北京索萊寶科技有限公司；氯化膽堿、乳酸、葡萄糖、乙二醇、丙三醇、1,3-丁二醇、尿素 皆為國產分析純。

UV-759型分光光度計 上海精密科學儀器有限公司；JY92-IIDN型超聲波儀 寧波新芝生物科技股份有限公司；FW100型粉碎機 天津市泰斯特儀器有限公司；HH-M6型恒溫水浴鍋 江蘇春蘭科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 制備DES溶液 選擇DES氫鍵受體組分與氫鍵供體組分按照一定的摩爾比，在65～80 ℃的水浴中加熱攪拌至溶液澄明，得到6種DES[16?18]，DES具體組成如表1所示。

表1 不同類型的DESTable 1 Different types of DES

1.2.2 玉米芯總黃酮提取 玉米芯烘干至恒重，粉碎。精確稱量1.0 g玉米芯粉末，加入20 mL DES，于功率120 W、50 ℃條件下超聲提取10 min，提取液過濾，取濾液待測。

1.2.3 DES的篩選 分別用上述不同編號的DES作為提取液，按照1.2.2方法提取玉米芯總黃酮，測定黃酮含量。進行3次平行實驗，選擇黃酮提取量較高的DES進行后續操作。

1.2.4 DES最適摩爾比和含水量篩選 選擇經1.2.3篩選出的DES，分別改變該溶劑的組分摩爾比（1:1、1:2、1:3、1:4、1:5）和含水量（10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%）后提取玉米芯總黃酮，測定黃酮含量。每組實驗做3組平行。

1.2.5 提取條件單因素實驗 經1.2.3和1.2.4篩選綜合考量，選擇最適DES進行玉米芯總黃酮的提取。分別改變提取操作中提取溫度（40、50、60、70、80 ℃）、液料比（10:1、15:1、20:1、25:1、30:1 mL/g）、超聲功率（40、80、120、160、200 W）和超聲提取時間（5、10、20、30、40 min）等提取條件，各組實驗除變量條件外，其它操作條件同1.2.2。測定各實驗組黃酮含量，以考察提取條件變化對總黃酮提取效果的影響。每組實驗平行操作3次。

1.2.6 響應面試驗設計 以1.2.5中4個因素為響應因素、單因素實驗結果為因素水平的選擇依據、總黃酮的提取量（Y）為響應值，設計響應面試驗，確定最佳提取工藝條件。實驗因素水平見表2。

表2 響應面因素設計與編碼Table 2 Box-Behnken factor design and coding

1.2.7 總黃酮含量測定 參考文獻[19]方法，使用蘆丁標準品溶液繪制標準曲線，測定提取液中總黃酮含量。總黃酮提取量計算公式為：

式中：Y為單位質量玉米芯總黃酮提取量，mg/g；C為從標準曲線中計算得出的總黃酮質量，mg；M為樣品質量，g；Df為稀釋倍數。

1.3 數據處理

實驗中響應面試驗設計及數據處理使用Design expert 8.0.6；單因素實驗數據處理使用SPSS16.0和Microsoft office excel 2016。

2 結果與分析

2.1 DES組成的篩選

使用6種不同組成的DES提取玉米芯總黃酮，各組提取量見圖1。由圖1可知，DES-4和DES-6的總黃酮提取量都明顯高于另外幾種（P<0.05），其中DES-4的黃酮提取量最大，這是因為DES-4的黏度最小（50 ℃，1.20 mPa·s）、熔點最低（?66 ℃），黏度小有利于目標物的擴散和提高傳質，而熔點越低也越有利于提取過程中介質的傳輸[20]，所以DES-4提取效果最為理想。DES-6的提取量略低于DES-4，差異不顯著（P>0.05），但DES-6的黏度高于DES-4，流動性較差，后續采用大孔樹脂吸附純化時，可能會導致上樣流速過慢甚至堵柱，容易對分離、純化操作造成不利影響，不過DES黏度會隨著其比例組成、溫度和含水量等因素的變化而改變，故在后續操作過程中仍有改善的可能[21?22]。因此，選擇DES-4和DES-6兩種溶劑進行后續實驗。

圖1 不同DES的總黃酮提取量Fig.1 Extraction of total flavonoids from different DES

2.2 DES組分比例的篩選

2.1 實驗中DES-4和DES-6兩種溶劑的總黃酮提取量差異不顯著（P>0.05），故后續考察該兩種溶劑的組成成分比例對提取量的影響，結果見圖2。由圖2可知，DES-4中氯化膽堿/乙二醇的比例由1:1上升至1:3時，總黃酮的提取量顯著上升（P<0.05）并至最大值，再繼續增加乙二醇的含量，總黃酮的提取量顯著下降（P<0.05），這是因為DES中氫鍵供體較少時，隨著其比例的增加，溶液中兩種組分間的作用力增強，溶液中離子與黃酮化合物之間的親和力增強，所以黃酮提取量上升[23]；另外增加氫鍵供體能使DES的表面張力減小、黏度降低，可以提高目標產物的擴散和轉移能力[24]；隨著乙二醇比例的繼續增大，氯化膽堿在溶劑中比例越來越低，使得黃酮類成分和溶劑的相互作用減弱，從而導致提取量又呈下降趨勢[25]。DES-6組成比例的變化對總黃酮提取量的影響趨勢不同于DES-4，氯化膽堿/1,3-丁二醇比例由1:1升至1:2時，總黃酮的提取量變化不顯著（P>0.05）；隨著試劑中1,3丁二醇的含量增加，黃酮的提取量又隨之下降，下降幅度也不顯著（P>0.05）。

圖2 DES（氯化膽堿/乙二醇、氯化膽堿/1,3-丁二醇）的組成比例對總黃酮提取量的影響Fig.2 Extraction of total flavonoids using the DES (choline chloride/ethylene glycol andcholine chloride/1,3-butyleneglycol)with different ratios

2.3 DES的含水量的影響

DES的含水量影響DES的黏度和極性，對目標產物的提取量有很大影響，因此需要對其進行含水量考察，實驗時，選擇氯化膽堿/乙二醇為1:3，氯化膽堿/1,3-丁二醇為1:2，結果見圖3。

圖3 DES（氯化膽堿/乙二醇、氯化膽堿/1,3-丁二醇）的含水量對總黃酮提取量的影響Fig.3 Extraction of total flavonoids using DES (choline chloride/ethylene glycol and choline chloride/1,3-butyleneglycol) with different water content

由圖3可知，DES-4和DES-6兩種溶劑的含水量由10%遞增至40%時，總黃酮的提取量都有顯著的變化（P<0.05），皆呈先上升后下降的趨勢，而且都是在含水量為30%時，總黃酮的提取量達到最大值，其中DES-4的最高提取量顯著高于DES-6（P<0.05）。含水量會影響DES的極性，當提取試劑與玉米芯黃酮有相似的極性時，提取效果更為理想[26]。另外，在含水量較低時，DES黏性較大，隨著溶劑中含水量的增加，黏性改善使得總黃酮的提取量提升顯著；含水量過高，溶液中的水分子會破壞氫鍵受體和供體之間形成的超分子化合物，并且使溶劑的極性偏離合適范圍[27]，從而導致總黃酮的提取量降低。從結果來看，含水30%的氯化膽堿/乙二醇組合提取玉米芯總黃酮量最高。

綜合篩選結果，選擇含水量為30%、氯化膽堿/乙二醇為1:3的DES作為玉米芯總黃酮的提取試劑。

2.4 單因素實驗結果

使用上述最優配比的DES，分別考察提取溫度、液料比、超聲功率和提取時間對玉米芯總黃酮提取量的影響。

2.4.1 提取溫度對提取量的影響 溫度會影響DES的黏度，從而影響分子的移動和擴散速度，更會改變DES中氫鍵受體和供體之間的相互作用，對提取量造成影響。如圖4所示，溫度對玉米芯總黃酮的提取影響顯著。提取溫度不高于60 ℃時，此時溫度相對較低，隨著溫度的上升，DES的黏度和表面張力都變小，黃酮在溶液中的傳輸能力上升，故提取量上升；當溫度超過60 ℃后，分子運動速度過快，溶液中氫鍵供體和受體兩種成分間氫鍵穩定性降低[28]，導致目的物溶出能力下降。另外，溫度升高會導致DES極性降低，高溫時DES極性與玉米芯總黃酮極性差異過大也是導致提取量下降的原因[29]。綜上，60 ℃時黃酮的提取量最高，為3.967 mg/g。

圖4 提取溫度對提取量的影響Fig.4 Effect of temperature on extraction amount

2.4.2 液料比對提取量的影響 考察液料比各變量對玉米芯總黃酮提取量的影響，以確定響應面試驗液料比的優化范圍，結果見圖5。液料比值較小時，目的物的提取量隨著該值的上升顯著提高，在液料比達到20:1 mL/g時，提取量達到最高值，之后再增加試劑用量，提取量下降。這是因為提取試劑用量少時，目的成分傳質不充分，其在固相中殘留率高[30]；而提取試劑過多時，大量的提取試劑會吸收一部分超聲輻射，從而減少輻射能量對材料的作用而妨礙有效成分的溶出[31]。另外，雜質的溶出也會導致目的物的溶解度降低。故最理想的液料比為20:1 mL/g，此時黃酮提取量達到3.675 mg/g。

圖5 液料比對提取量的影響Fig.5 Effect of liquid-solid ratio on extraction amount

2.4.3 超聲功率對提取量的影響 空化效應是超聲提取時促使目的物溶出的主要因素，超聲功率會影響空化效應的強度。結果見圖6。超聲功率改變對總黃酮提取量的變化影響顯著。超聲功率較低時，空化效應不強，對細胞壁的破壞能力弱，黃酮溶出速度慢、溶出量小；超聲功率增加時，空化效應加強，細胞壁破碎加劇，分子的運動速度增加，擴散加快[32?33]。所以，目的物的提取量會隨著超聲功率的增強而增加，超聲功率達到120 W時，提取量最高，再繼續增加超聲強度，提取溶液會發生“飽和效應”，大功率的超聲作用下會導致有效成分結構和DES超分子結構的破壞[34]，使提取量下降；另外，大功率下雜質的大量溶出也會導致目的物的溶出受阻，降低提取量。因此，最優超聲提取功率為120 W，該功率條件下黃酮的提取量為3.158 mg/g。

2.4.4 提取時間對提取量的影響 提取時間的長短會決定目的物質能否充分溶出，其對提取量的影響見圖7。通過圖7可以看出，提取時間短時，目的物溶出量小；提取時間從5 min提高到20 min時，提取量不斷上升且前期升幅顯著；提取時間超過20 min后，提取量會有明顯下降。這是因為空化效應不僅受超聲功率的影響，隨著超聲時間的延長和能量的積累，空化效應也會增強，從而破壞細胞壁，使目的物溶出量加大，在提取時間達到20 min時，大多數目的物溶出，繼續延長超聲時間提取量不會明顯變化，甚至可能會有大量雜質溶出導致目的物溶出受限；另外，更長時間的超聲輻射和熱效應的積累還容易導致產物“雙重降解”[35?36]。綜上所述，提取時間選擇20 min最為理想，此時黃酮的提取量為3.907 mg/g。

2.5 響應面試驗結果與優化分析

2.5.1 回歸模型建立與顯著性檢驗 按照Box-Behnken試驗，設計了包含16個析因點、5個中心點和8個軸點在內的總計29組實驗，進行3組平行實驗。設計及結果見表3。

表3 試驗設計與結果Table 3 Design and results of experiment

對上表數據進行二次多項式回歸擬合，4因素回歸方程式如下：

其顯著性檢查與方差分析見表4。

表4 方差分析表Table 4 Variance analysis for regression equation

從方差分析表可知，該回歸模型P<0.01，表明其可靠程度高、結果有效。R2=0.9853、校正系數R2Adj=0.9706、失擬項P=0.9995>0.05不顯著，表明模型擬合度高，即擬合值與實際結果高度相關，實驗結果誤差對實驗結果影響較小。模型的C.V.值0.92%、信噪比為26.24，表明模型的實驗精度高、可靠性好，模型能真實地反映實驗結果。在所有考察因素中，提取溫度、液料比和超聲功率對提取量影響顯著；其中，對玉米芯總黃酮的提取量影響最大的是A（提取溫度），其次為C（超聲功率）和B（液料比），影響最小的是D（提取時間）。

2.5.2 數學模型及響應面分析 根據所得到的模型對提取溫度（A）、液料比（B）、超聲功率（C）和提取時間（D）的交互作用進行分析。響應曲面和等高線的陡峭和平緩程度與上述各因素之間相互作用的強弱是正相關的。各參數交互作用的響應曲面見圖8。

由圖8可知，在A、B、C、D四個因素中任意兩個因素的交互作用時，其中一個因素條件不變時，總黃酮的提取量都是隨著另一因素的增加先提高后降低的，影響玉米芯中的總黃酮提取量的各交互作用因素順序為AD>AB>BD>BC>CD>AC。

圖8 各因素交互作用的響應面圖Fig.8 Response surface of interaction of various factors

2.5.3 驗證實驗 通過對實驗模型進行分析，經過Design Expert 8.0優化后的最佳提取工藝為：提取溫度61.18 ℃、液料比為20.40:1 mL/g、超聲功率137.30 W、超聲提取時間19.34 min，理論預計提取量4.21 mg/g。在驗證實驗中，考慮實際條件，將操作工藝參數調整為提取溫度61 ℃、液料比20:1 mL/g、超聲功率137 W、提取時間19.5 min，作5組平行實驗。上述條件下玉米芯總黃酮提取量的實際值為4.180 mg/g，與軟件模擬預測值誤差為0.71%，實際與模型優化符合良好，證實了模型的有效性。

3 結論

實驗采用超聲輔助低共熔溶劑提取玉米芯中總黃酮。經過對多種組成、配比和含水量的DES的篩選，最終選擇含水量30%、氯化膽堿/乙二醇比例為1:3的溶劑作為實驗提取試劑。在單因素實驗的基礎上，通過響應面試驗設計對提取條件進行優化，建立數字模型方程，得到最優提取工藝參數為提取溫度61 ℃、液料比20:1 mL/g、超聲功率137 W、提取時間19.5 min，此條件下總黃酮的提取量為4.180 mg/g，與模型的預測值相近，本實驗得到的玉米芯總黃酮提取量分別比常麗新等[37]和劉曉飛等[38]報道的玉米芯黃酮提取量高45%和31%。與傳統溶劑提取方法相比，DES提取法成本低、安全性好、對環境友好，輔以超聲可對目的成分高效浸出，所需溶劑少，可重復利用，是一種快速、高效提取黃酮類物質的理想方法。