不同菌種發酵大蒜液的品質比較分析

牛娜娜，郭 璐，羅 丹，王珍珍，沙如意, ，韓洪庚，張黎明，戴 靜，毛建衛,3

（1.浙江科技學院生物與化學工程學院，浙江省農業生物資源生化制造協同創新中心，浙江省農產品化學與生物加工技術重點實驗室，浙江杭州 310023；2.江蘇黎明食品集團有限公司，江蘇徐州 221354；3.浙江工業職業技術學院，浙江紹興 312000）

大蒜（Allium sativumL.）為百合科蔥屬植物的地下鱗莖，具有強烈辛辣味，蒜頭、蒜苗和蒜苔不僅可作蔬菜、調料味食用，而且可入藥，是著名的藥食兩用植物[1]。大蒜富含蛋白質、糖類、含硫化合物、生物活性酶等物質，具有多種藥理價值，如抗氧化、清除自由基[2]、降血脂[3]、抗腫瘤[4]、抗病原微生物[5]、改善血液循環、緩解疲勞等作用，長期食用可起到防病保健作用[6]。

目前，大蒜的初級加工產品種類較少，主要有糖醋蒜、黑蒜、蒜粉、蒜片等。現有的大蒜產品中，大蒜特有的辛辣氣味和刺激性氣味限制了其作為食品和食品配料的廣泛應用[7]。利用微生物菌種對大蒜進行發酵，能夠富集營養成分，降低辛辣和刺激性氣味，以制備發酵大蒜產品，也是未來大蒜加工的一個重要方向[8]。侯進慧等[9]采用植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌和鼠李糖乳桿菌復合發酵大蒜30 d之后，大蒜蒜味逐漸消失，并產生香味，口感顯著改善。

釀酒酵母是對人體有益的一類微生物，常被用來釀酒，具有產酒精濃度高和發酵速度快等優點，使之成為常用的一類菌種[10]；植物乳桿菌屬于同型發酵乳酸菌，廣泛應用于食品發酵過程中，如酸奶、面包和泡菜[11]；在繁殖過程中產出的乳酸桿菌素，是一種生物型防腐劑[12]；能發酵乳糖或葡萄糖酸鹽，產生大量的乳酸[13]。目前，利用釀酒酵母和植物乳桿菌進行果蔬的發酵，已經有諸多研究報道和應用研究[14?16]，利用菌種對大蒜進行發酵的研究報道較少，因此本文通過研究不同發酵菌種發酵制備發酵大蒜液，為大蒜深加工產品的進一步開發提供科學指導。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大蒜 購買于江蘇邳州；釀酒酵母（菌種編號：CICC 1012）、植物乳酸菌（菌種編號：CICC 21786） 中國工業微生物菌種保藏管理中心（CICC）；低聚異麥芽糖 保齡寶生物股份有限公司；甲醇（色譜純） 美國Thermo Fisher Scientific公司；乙醇（優級純），叔丁醇、磷酸二氫鉀、抗壞血酸、醋酸、乳酸（色譜純） 上海阿拉丁化學試劑有限公司；草酸、蘋果酸、檸檬酸（均為標準品） 中國藥品生物制品鑒定所；其余試劑 均為國產分析純。

SpectraMax iD5多功能酶標儀 美國Molecular Devices公司；GC-2010氣相色譜 日本島津公司；HSS86.50頂空進樣器 意大利DANI公司；SA402B型味覺感應系統 日本Insent公司；Waters e2695型高效液相色譜 美國Waters公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種的培養 釀酒酵母：YEPD液體培養基，接種后在30 ℃培養36～48 h；植物乳桿菌：MRS液體培養基，接種后在30 ℃培養24～48 h。

釀酒酵母發酵種子液：向滅菌的純水中加入5%的釀酒酵母菌液體培養基（107CFU/mL）。

植物乳桿菌發酵種子液：向滅菌的純水中加入5%的植物乳桿菌液體培養基（107CFU/mL）。

1.2.2 發酵大蒜液的制備 將大蒜去皮，用無菌水沖洗無霉變、無腐爛、無機械損傷的大蒜，自然瀝干，打漿粉碎后用紫外照射燈輻射處理30 min后備用[9]。將低聚異麥芽糖用紫外燈輻射30 min，將大蒜、低聚異麥芽糖和發酵種子液（釀酒酵母、植物乳桿菌）以質量比為1:1:3加入經高壓蒸汽滅菌后的20 L不銹鋼發酵罐中，于20±5 ℃下避光發酵，定期取大蒜發酵液樣品50 mL，發酵前16 d，每隔4 d取一次樣，發酵16至80 d，每隔8 d取一次樣，將所取樣品液于6000 r/min條件下離心15 min，將上清液保存于?80 ℃超低溫冰箱中，待測。

1.2.3 總酚含量測定 參考薛淑龍等[17]方法并作修改，測定樣品中總酚含量。分別取原液100 μL，加入10%福林酚溶液500 μL，振蕩混勻，靜止3 min，加入7.5% Na2CO3溶液400 μL，振蕩混勻，避光反應1 h，取150 μL加入到96孔板，于765 nm處測定吸光度，空白水為對照組。

1.2.4 可滴定酸含量測定 參照GB/T 12456-2021《食品安全國家標準 食品中總酸的測定》[18]，使用電位滴定儀測定樣品中的可滴定酸含量，測定結果以乳酸質量分數（g/100 mL）計。

1.2.5 甲醇、乙醇含量的測定 參照范昊安等[19]方法并作修改，測定樣品中甲醇、乙醇的含量。

混合標準溶液配制：以終質量濃度為10 g/L的叔丁醇作為內標，配制質量濃度為0.1、0.5、1、1.5、2、2.5、5 g/L和0.5、1、5、10、15、20、25、50 g/L的甲醇、乙醇混合標準溶液，待測。樣品配制：將樣品稀釋10倍，加入終質量濃度為10 g/L的叔丁醇作為內標，待測。自動頂空條件：爐溫85 ℃，平衡時間40 min；進樣閥溫度105 ℃；傳輸線溫度110 ℃。氣相色譜條件：RTX-5毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；柱溫40 ℃，平衡時間3 min，10 ℃/min升溫至180 ℃，保溫5 min；進樣口溫度200 ℃；分流比30:1；檢測器溫度250 ℃。

1.2.6 有機酸的測定 采用高效液相色譜法測定樣品中有機酸含量[20]。液相色譜分析條件，色譜柱：AtiantisRT3柱（250 mm×4.6 mm i.d，5 μm），檢測波長為210 nm，V（甲醇）:V（0.01 mol/L KH2PO4，用磷酸調pH2.7）=2:98，柱溫20 ℃，流速為1 mL/min，進樣量為10 μL。配制酒石酸、蘋果酸、乳酸、醋酸、檸檬酸和琥珀酸濃度分別為0.1、0.5、1、1、1、1 mg/mL的混合標準溶液，上機檢測。將樣品用0.01 mol/L的KH2PO4溶液（pH2.7）稀釋10倍，過0.22 μm微孔濾膜，上機檢測。

1.2.7 電子舌滋味分析 采用電子舌[21]分析不同發酵時間樣品的味感變化。取1 mL樣品，用超純水定容至100 mL容量瓶中，裝入電子舌專用燒杯中。每秒采集1次數據，共采集120 s，清洗330 s。使用CTO、CAO、C00、AE1傳感器分別對樣品的咸味、酸味、苦味（及其回味）和澀味（及其回味）進行檢測，每個樣品重復測定4次；使用GL1傳感器檢測樣品的甜味，每個樣品重復測定5次，均選取最后3次的穩定數據納入分析。

1.2.8 羥自由基清除能力的測定 參照趙優萍等[22]方法并作修改，進行樣品測定。取200 μL樣品，加入140 μL 6mmol/L H2O2溶液，60 μL 20 mmol/L水楊酸鈉和200 μL 1.5 mmol/L硫酸亞鐵，振蕩混勻，37 ℃下恒溫水浴1 h，取150 μL加入到96孔板，于510 nm處測定吸光度，空白水為對照組。羥基自由基清除能力計算公式：

式中：A0為空白對照液的吸光度；A1為樣品測定的吸光度；A2為樣品本底的吸光度。

1.3 數據處理

每組實驗均重復三次，采用Origin 8.6軟件繪制圖，結果以平均值±標準差（SD）表示。利用SPSS 22軟件進行相關性分析，利用HemL 1.0軟件進行相關性熱圖分析。

2 結果與分析

2.1 不同菌種發酵過程中總酚含量的變化

酚類物質存在于大蒜原料中，研究發酵大蒜液中的酚類物質，對開發高活性大蒜發酵液產品具有重要的研究價值和意義，大蒜發酵液中的酚類物質含量直接影響產品的口感及抗氧化性等[23]。對分別接種釀酒酵母和植物乳桿菌的大蒜發酵液中總酚含量進行跟蹤檢測，結果見圖1，由圖1可知，大蒜發酵液制備過程中，總酚含量在發酵4 d內明顯下降，4 d后均呈現出近乎直線上升的趨勢，與發酵第4 d的大蒜發酵液相比，其余發酵時間點的總酚含量均有明顯提高，大蒜發酵液前期總酚含量明顯下降的原因可能是部分酸性酚類物質在中性環境下降解生成其它物質[24]，在整個發酵過程中，植物乳桿菌發酵組的總酚含量高于釀酒酵母發酵組。

圖1 不同菌種發酵過程中總酚含量的變化Fig.1 Changes of total phenol content during fermentation of garlic by different strains

2.2 不同菌種發酵過程中可滴定酸的變化

可滴定酸是衡量發酵大蒜液品質的重要理化指標之一，也是衡量大蒜發酵液成熟度的重要指標。由圖2可知，在整個發酵過程中，可滴定酸含量均呈現出上升的趨勢。釀酒酵母是一種單細胞真菌，屬于兼性厭氧菌，在有氧和無氧的條件下均能生存，釀酒酵母在有氧的條件下可以大量繁殖，因為大蒜中的抑菌物質存在可以抑制酵母菌的代謝，產生二氧化碳和水，只有部分二氧化碳溶于水，在發酵后期則進行無氧呼吸產生酒精和二氧化碳[25]，因此前期釀酒酵母組的可滴定酸含量較低。植物乳桿菌產生乳酸，乳酸可以被氧化成醋酸[26]。在發酵后期，釀酒酵母組中可滴定酸含量高于植物乳桿菌組，可能主要與菌種發酵制得的大蒜發酵液中形成的有機酸有關。

圖2 不同菌種發酵過程中可滴定酸的變化Fig.2 Changes of titration acid during fermentation of garlic by different strains

2.3 不同菌種發酵過程中有機酸的變化

將質量濃度在0.001～1.0 mg/mL范圍內的系列有機酸混標溶液進行HPLC分析，以各標準有機酸質量濃度（x）對峰面積（y）進行線性回歸，結果見表1。由表1可知，各有機酸標準曲線決定系數R2均≥0.998，表明在既定的濃度單位內，峰面積和有機酸質量濃度之間的線性關系較好。

表1 6種有機酸標準品標準曲線回歸分析Table 1 Regression analysis of standard curves of six organic acid standards

大蒜發酵液中的有機酸，除部分來源于大蒜原料固有的有機酸溶出外，還有一部分是通過產酸微生物的代謝而形成[27]。有研究報道表明[18]，果蔬自然發酵過程中的優勢菌種主要為酵母菌、醋酸菌和乳酸菌等。酵母菌主要通過糖酵解和三羧酸循環途徑，在其生長期內可產生大量的有機酸；而植物乳桿菌通過一系列復雜的代謝過程可以產生乳酸等有機酸[28]。由圖3可知，大蒜發酵液中的有機酸種類豐富，且因發酵菌種生長和代謝而發生改變，主要的有機酸為蘋果酸和乳酸，酒石酸、蘋果酸、乳酸、醋酸、檸檬酸和琥珀酸是發酵大蒜的重要組成部分。葉秀娟等[29]相關研究報道表明，使用高效液相色譜法檢測到泡蒜中6種有機酸，其中檸檬酸含量最高，為2.62 mg/g，這主要可能是因大蒜產品品種差異所致。大蒜發酵液中高含量的有機酸，也是造成其發酵過程中可滴定酸含量不斷增加的重要原因。

圖3 不同菌種發酵過程中有機酸含量的變化Fig.3 Changes of organic acid content during fermentation of garlic by different strains

2.4 不同菌種發酵過程中的滋味分析

電子舌可以清晰地區分不同樣品中的各味感指標的差異。由圖4所示，兩種菌發酵制備發酵大蒜過程中，不同發酵時間的樣品之間咸味、甜味、酸味、苦味、澀味和苦味回味響應值存在明顯差異，而澀味回味響應值則無明顯變化。隨著發酵時間的延長，兩種菌發酵制備的大蒜發酵液中苦味響應值、苦味回味響應值、咸味響應值和甜味響應值均呈現出下降的趨勢，釀酒酵母組咸味響應值在發酵4～8 d時下降較大，植物乳桿菌組苦味回味響應值和咸味響應值在發酵前4 d時下降較多；釀酒酵母組酸味響應值和澀味響應值呈現出勻速增長后趨于穩定的趨勢，植物乳桿菌組酸味響應值和澀味響應值呈現出迅速增長后趨于穩定的趨勢，其中植物乳桿菌組在第8 d時，酸味響應值達到最高為17.58±0.02。酸味響應值結果與有機酸測定結果一致，進一步說明了經微生物代謝以后產生的蘋果酸和乳酸是酸味的主要來源[30]；苦味物質大部分存在于植物中，可在食物加工、老化及變質過程中形成[31]；咸味的產生與鹽解離出的陽離子關系密切，添加少量的甜味劑對咸味有削弱作用[32]，通過外源添加低聚異麥芽糖可降低大蒜發酵液中的咸味響應值；甜味由蔗糖、葡萄糖、果糖構成，釀酒酵母和植物乳桿菌發酵的大蒜在發酵過程中消耗大蒜和原料中的碳源，因此甜味響應值均呈現出下降的趨勢。

圖4 不同菌種發酵過程中的滋味分析Fig.4 Taste analysis of different strains during fermentation

2.5 不同菌種發酵過程中羥基自由基清除能力的變化

羥基自由基是氧自由基中最為活潑的自由基，過量的羥基自由基會引起鄰近生物分子的嚴重損傷[18]。大蒜發酵液在制備過程中羥基自由基清除能力的變化如圖5所示，由圖5可知，在大蒜發酵過程中，兩種單菌種發酵制備得到的大蒜發酵液，羥基自由基清除能力呈現出迅速降低后上升的趨勢，且在發酵4 d時，羥基自由基清除能力最低，與總酚趨勢一樣。相關研究表明，羥基自由基的清除能力與果蔬中的總酚含量有一定關系[33]，大蒜發酵液的羥基自由基清除能力在發酵4 d時趨近于零，表明大蒜發酵液中的促氧化與抗氧化作用基本達到平衡[34]。王征帆[35]相關研究表明，大蒜水提物對羥基自由基具有較強的清除作用，本文通過菌種發酵制備的大蒜發酵液，與發酵4 d相比均表現出具有較高的羥基自由基清除率，植物乳桿菌組發酵的大蒜提取液在第80 d時，羥基自由基清除能力為99.88%±0.05%，明顯高于釀酒酵母組。

圖5 不同菌種發酵過程中羥基自由基清除能力的變化Fig.5 Changes of hydroxyl free radical removal capacity during fermentation by different strains

2.6 不同菌種發酵過程中甲醇、乙醇含量的變化

果蔬發酵產品中，甲醇和乙醇的含量是重要的安全性控制指標。甲醇是反映發酵制品質量控制的重要指標之一，大蒜發酵液在制備過程中甲醇含量的變化如圖6所示。由圖6可知，大蒜在發酵過程中甲醇的含量均呈現出先升高后趨于穩定的趨勢，其中植物乳桿菌組產生的甲醇含量高于釀酒酵母組，但均低于0.5 g/L。甲醇對人體的健康的危害極大，尤其對視網膜、呼吸及神經系統具有明顯的麻痹、毒害作用[36]。根據《食品安全國家標準 蒸餾酒及其配制酒》（GB 2757-2012）規定[37]，蒸餾酒中的甲醇的最大限量值為2.0 g/L，按此規定，本研究制備的兩種發酵大蒜液均符合食品安全相關標準。

圖6 不同菌種發酵過程中甲醇含量的變化Fig.6 Changes of methanol content during fermentation by different strains

大蒜在發酵制備過程中乙醇含量的變化結果如圖7所示。由圖7可知，大蒜發酵過程中乙醇的含量均呈現出先升高后趨于穩定的趨勢，其中釀酒酵母組產生的乙醇含量高于植物乳桿菌組，但均低于5 g/L。植物發酵產品中產生的乙醇含量最大限量一

圖7 不同菌種發酵過程中乙醇含量的變化Fig.7 Changes of ethanol content during fermentation by different strains

般為5 g/L，本文兩種菌發酵制備得到的發酵大蒜提取液，乙醇含量均符合相關食品安全標準[38]。乙醇是釀酒酵母發酵后形成的主要產物，高濃度乙醇對酵母細胞會產生抑制作用，主要體現為降低酵母細胞存活率和細胞生長速率，進而導致發酵過程的終止[10]。

2.7 大蒜發酵液各理化指標與有機酸的相關性分析

利用不同菌種發酵制備大蒜發酵液，發酵大蒜中的各理化指標可能都影響其有機酸的代謝和轉化。為了研究不同發酵大蒜提取液中不同理化指標與有機酸的關系，進一步對大蒜在發酵過程各理化指標（總酚、可滴定酸、甲醇、乙醇、羥基自由基清除能力）與有機酸（酒石酸、蘋果酸、乳酸、醋酸、檸檬酸、琥珀酸）含量進行相關性分析，結果如圖8所示。由圖8可知，不同菌種制備的大蒜發酵提取液，其主要理化指標與有機酸含量之間均表現出顯著的正相關性（P<0.05），表明各理化指標均對有機酸含量的增加有各自的貢獻。經不同菌種發酵制備的大蒜發酵液中總酚、可滴定酸、甲醇、乙醇、羥自由基清除能力與酒石酸、蘋果酸、乳酸、醋酸、琥珀酸之間存在非常顯著的相關性（P<0.01）；不同菌種發酵制備的大蒜發酵液中的總酚、可滴定酸、甲醇、乙醇、羥自由基清除能力與檸檬酸之間存在顯著的相關性（P<0.05）。通過相關性分析熱圖，進一步揭示了大蒜發酵提取液中的各理化指標與有機酸含量的增加有著密切的關聯。

圖8 不同菌種制備的大蒜發酵液各理化指標與有機酸的相關性分析熱圖Fig.8 Heat map of correlation analysis between various physical and chemical indexes of garlic fermentation broth prepared by different strains and organic acids

3 結論

本研究利用不同菌種（釀酒酵母或植物乳桿菌）對大蒜進行發酵制備大蒜發酵液，并對其理化指標和有機酸種類及含量進行檢測分析。結果表明，在發酵過程中，植物乳桿菌發酵制備的大蒜液總酚含量、可滴定酸含量、羥基自由基清除能力、甲醇含量均高于釀酒酵母，當植物乳桿菌組發酵至80 d時，羥基自由基清除能力為99.88%±0.05%；發酵大蒜中共檢測到六種有機酸（酒石酸、蘋果酸、乳酸、醋酸、檸檬酸、琥珀酸），其中蘋果酸和乳酸的含量較高；植物乳桿菌制備的發酵大蒜液酸味響應值最高為17.58±0.02，說明了經微生物代謝以后產生的蘋果酸和乳酸是酸味的主要來源。綜合評價兩種菌種對發酵大蒜制備過程中的品質影響為：植物乳桿菌優于釀酒酵母，該研究為菌種發酵大蒜產品的研究開發提供了理論基礎。