腸桿菌科細菌耐藥性的遺傳穩(wěn)定性

劉 鵬 ， 王少林

(中國農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院 ， 北京 海淀 100193)

腸桿菌科細菌是社區(qū)和醫(yī)院獲得性感染的重要病原體，多重耐藥腸桿菌科細菌的相繼出現(xiàn)極大地增加了疾病治療過程中的難度，已經(jīng)成為人類健康的重大威脅。耐藥性的維持通常會對細菌造成一定的適應性代價，表現(xiàn)為細菌生長速率、毒性和傳播的減弱，而補償性進化[1]、無適應性代價和適應性增加的耐藥突變的出現(xiàn)[2]、耐藥基因與其他基因的遺傳連鎖和協(xié)同選擇[3]以及質(zhì)粒的穩(wěn)定性機制[4]均在一定程度上促進了腸桿菌科細菌耐藥基因穩(wěn)定遺傳。本文綜述了腸桿菌科細菌的耐藥現(xiàn)狀和傳播現(xiàn)狀、耐藥基因適應性代價的研究方法和影響因素以及耐藥性穩(wěn)定遺傳的驅(qū)動因素，以期為解決腸桿菌科細菌抗生素耐藥性的持續(xù)存在這一重大公共衛(wèi)生問題提供新的視角。

1 腸桿菌科細菌的耐藥現(xiàn)狀和傳播現(xiàn)狀

腸桿菌科細菌屬于革蘭陰性菌家族，常在人類或者動物的腸道生存，是不同類型的社區(qū)和醫(yī)院獲得性感染的常見病原體之一。

氨基糖苷類抗生素是臨床治療革蘭陰性菌感染的老牌抗生素，腸桿菌科細菌主要通過產(chǎn)生氨基糖苷鈍化酶和修飾藥物作用靶點導致耐藥。其中產(chǎn)氨基糖苷鈍化酶是導致該類抗生素失活的最常見機制，其包括乙酰轉(zhuǎn)移酶(AACs)、腺苷轉(zhuǎn)移酶(ANTs)和磷酸轉(zhuǎn)移酶(APHs)。16S rRNA甲基化酶通過修飾藥物作用靶點，介導腸桿菌科細菌對大多數(shù)臨床常用氨基糖苷類抗菌藥物產(chǎn)生高水平耐藥，主要包括ArmA、RmtA和RmtB等，大多數(shù)16S rRNA甲基化酶的結(jié)構(gòu)基因均位于可轉(zhuǎn)移的質(zhì)粒，且與可移動遺傳因子相關聯(lián)，導致水平傳播。

氟喹諾酮類耐藥決定區(qū)(Quinolone resistance determining regions,QRDR)基因的點突變，是腸桿菌科細菌對氟喹諾酮類抗生素產(chǎn)生耐藥的主要原因，特別是多個位點同時突變導致高水平耐藥[5]。質(zhì)粒介導的喹諾酮耐藥基因(Plasmid-mediated quinolone resistance,PMQR)包括qnrA基因及其等位基因qnrS、qnrB、qnrD和qnrC，能降低環(huán)丙沙星活性的氨基糖苷乙酰轉(zhuǎn)移酶的變異體基因aac(6′)-Ib-cr和編碼藥物外排泵的基因(qepA和oqxAB)，雖然大多數(shù)PMQR帶來低水平的耐藥，但是由于PMQR既可以通過垂直傳播，也可以通過水平傳播的特性，給人類和動物的健康帶來了不容忽視的威脅。

β-內(nèi)酰胺類抗生素是目前應用最廣泛的藥物，其產(chǎn)生耐藥性的常見原因是β-內(nèi)酰胺酶的產(chǎn)生，包括超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)和頭孢菌素酶(AmpC酶)。產(chǎn)ESBLs和AmpC酶的腸桿菌科細菌均可以通過染色體和質(zhì)粒介導的方式傳播耐藥性，攜帶ESBLs和AmpC酶的質(zhì)粒通常也會協(xié)同氨基糖苷類、磺胺類、氟喹諾酮類等其他類耐藥基因共同轉(zhuǎn)移，擴大了腸桿菌科細菌引起感染的強度。臨床上常見的ESBLs主要包括blaTEM、blaSHV和blaCTX-M三大類別，其中blaCTX-M是世界各地普遍存在的ESBLs。

碳青霉烯類抗生素是一類非典型β-內(nèi)酰胺類抗生素，因其對β-內(nèi)酰胺酶穩(wěn)定，通常用于ESBLs和AmpC酶產(chǎn)生菌感染的治療，被視為治療多重耐藥革蘭陰性菌感染的最后一道防線[6]。碳青霉烯酶可以使碳青霉烯類抗生素失活，由碳青霉烯酶介導的耐藥機制是導致碳青霉烯類耐藥的腸桿菌科細菌(Carbapenem-resistantEnterobacteriaceae,CRE)快速傳播的重要原因[7]。迄今為止，CRE中傳播最廣泛的是肺炎克雷伯菌，它是導致呼吸道等醫(yī)療衛(wèi)生相關感染的重要原因。根據(jù)Ambler分類法，碳青霉烯酶可以分為A、B和D三類，KPC、IMP、VIM、OXA-48、NDM是常見的碳青霉烯酶，這些碳青霉烯酶常常位于質(zhì)粒、整合子、轉(zhuǎn)座子等可移動遺傳元件上，極大地增強了碳青霉烯類抗生素耐藥基因的迅速蔓延。2009年，新德里金屬β-內(nèi)酰胺酶(NDM)被首次報道，因為NDM對幾乎所有的β-內(nèi)酰胺酶藥物(除了多黏菌素和替加環(huán)素)耐藥，所以攜帶該基因的細菌被稱為“超級細菌”。

近年來，CRE的廣泛傳播嚴重影響了碳青霉烯類藥物的療效，多黏菌素和替加環(huán)素被認為是最為有效的CRE治療方案[7]。隨著2016年可轉(zhuǎn)移耐藥基因mcr-1在大腸桿菌中的發(fā)現(xiàn)，黏菌素的臨床潛力已經(jīng)被質(zhì)粒介導的mcr耐藥基因的全球傳播顯著削弱。當前腸桿菌科細菌中已經(jīng)有mcr-1和blaNDM共存的報導，甚至Sun等[8]在2016年報道了mcr-1和blaNDM共存于同一個質(zhì)粒。2019年，質(zhì)粒介導的高水平替加環(huán)素耐藥基因tet(X3)和tet(X4)在腸桿菌科細菌中被發(fā)現(xiàn)[9-10]。數(shù)據(jù)庫挖掘和回顧性篩選分析證實，tet(X3)和tet(X4)在臨床細菌中普遍存在，甚至與blaNDM-1共存的細菌中也存在[9]。同時，tet(X4)陽性的大腸桿菌菌株，包括與mcr-1共存的分離株，已在中國的豬、雞、土壤和灰塵樣品中廣泛檢測到[10]。這些報道為我們敲響了警鐘。試想，如果 CRE同時攜帶mcr和tet(X)，則會成為無敵的“超級細菌”，人類的感染將真正地陷入無藥可治的局面。

2 腸桿菌科細菌耐藥基因的適應性代價

2.1 適應性代價的產(chǎn)生原因 面對抗生素選擇壓力時，細菌可以通過新生突變和耐藥基因水平轉(zhuǎn)移(結(jié)合、轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)導)2種方式獲得耐藥性，而當抗生素壓力消除后，由于這些耐藥突變機制改變了細菌體內(nèi)在生理生化中起關鍵作用酶的結(jié)構(gòu)和表達，通常會給菌體的正常代謝帶來額外的負擔，導致細菌適應性的降低，表現(xiàn)為細菌生長速率、毒性和傳播的減弱，從而產(chǎn)生了適應性代價[11]。特別是在缺乏抗生素選擇壓力下，如果耐藥機制的適應性代價較大，耐藥細菌將無法與敏感細菌競爭，從而會很快從群體中消失。所以適應性代價是影響耐藥性可逆性的重要生物學參數(shù)，是決定耐藥菌能否在細菌群體中長久維持的重要因素[11]。

2.2 適應性代價的研究方法 測量適應性代價的常見試驗方法有2種，包括菌株的生長曲線的測定和競爭性試驗。在相同的純培養(yǎng)條件下，通過測量耐藥菌株和敏感菌株在600 nm處的光密度(OD600)隨時間的變化曲線，通過比較菌株的最大生長速率(vmax)、最大的OD600(ODmax)、生長曲線下面積(AUC)和延遲期(Lag)的差別來評估適應性代價的大小[12-13]，如圖1A所示。競爭性試驗被認為是研究適應性代價的黃金標準，包括體外競爭試驗(圖1B)和體內(nèi)競爭試驗(圖1C)，體外競爭試驗是在標準培養(yǎng)基中進行，體內(nèi)競爭性試驗是在分離耐藥菌株常見的動物宿主中進行的，將耐藥菌株和敏感菌株以1∶1的計數(shù)比例共培養(yǎng)，通過監(jiān)測競爭前后耐藥菌株和敏感菌株的計數(shù)比值的變化，直觀地反應耐藥菌株的適應性強弱，如果耐藥菌株存在適應性代價，計數(shù)的比值將會變小。Lenski等[14]提出的相對適應性(Relative fitness)的計算方法被廣泛用來評估耐藥菌株的適應性，計算方式：Relative fitness=ln(A1/A0)/ln(B1/B0)，A0和B0分別是競爭開始時突變菌株和野生菌株的細胞數(shù)量，A1和B1分別是競爭結(jié)束后耐藥菌株和敏感菌株的細胞數(shù)量。

圖1 適應性代價的試驗性測量方法

2.3 影響耐藥性適應性代價的主要因素 不同的遺傳背景下，耐藥基因的適應性代價有所不同。Vogwill等[15]通過對發(fā)表的耐藥性適應性代價的文獻進行匯總分析，發(fā)現(xiàn)相對于染色體突變產(chǎn)生的耐藥性，細菌獲得介導耐藥性的質(zhì)粒的平均適應性代價較小。這可能是由于染色體突變是細菌基因組上的新生突變，細菌最初不可能擁有適應能力來抵消這些基因突變的代價。相反，當細菌通過獲得質(zhì)粒而進化出耐藥性時，它們就獲得了一種耐藥性決定因素，這種決定因素已經(jīng)經(jīng)歷了選擇，以使其代價最小化[15]。相同的質(zhì)粒在不同的宿主中的適應性代價不同。Porse等[13]從臨床獲得的肺炎克雷伯菌(Kp33)中分離出1株巨大的結(jié)合質(zhì)粒pKP33，將其結(jié)合轉(zhuǎn)移到不同宿主后，發(fā)現(xiàn)大腸桿菌(Ec37和Ec38)結(jié)合pKP33產(chǎn)生的適應性代價顯著高于肺炎克雷伯菌(Kp08)結(jié)合pKP33的適應性代價。

耐藥基因的適應性代價受不同環(huán)境壓力的影響。Lin等[16]通過耐利福平菌株與敏感菌株在不同營養(yǎng)水平下的競爭試驗，發(fā)現(xiàn)在富營養(yǎng)化條件下，耐藥菌株與敏感菌株的絕對數(shù)量比值迅速下降，而在貧營養(yǎng)化條件下，耐藥菌株與敏感菌株的絕對數(shù)量比值緩慢下降或保持穩(wěn)定，這表明貧營養(yǎng)化條件下，耐藥細菌變得更有競爭力。環(huán)境溫度也是影響適應性代價的重要因素，研究發(fā)現(xiàn)相比于37 ℃條件，在42 ℃條件下IncK1質(zhì)粒的適應性代價更高，而IncK2質(zhì)粒的適應性代價在37 ℃條件或者在42 ℃條件下沒有顯著變化，這可能是IncK2主要在家禽中被發(fā)現(xiàn)，而IncK1總是在各種哺乳動物中被報道的原因[17]。

耐藥基因的適應性代價與基因的異位顯性效應(Epistasis)有關，異位顯性也稱上位性[18]，指一個基因突變受其他已存在的基因突變影響的現(xiàn)象，正向異位顯性效應能減少適應性代價，負向異位顯性效應相應地增加適應性代價。研究發(fā)現(xiàn)，對鏈霉素和利福平耐藥的大腸桿菌(RifR和StrR)的適應性代價均遠遠高于單一耐藥的大腸桿菌(RifR或者StrR)[19]。相對于負向異位顯性效應，正向異位顯性效應較普遍，這在一定程度上也加快了多重耐藥性的傳播和進化。

3 腸桿菌科細菌耐藥基因穩(wěn)定遺傳的驅(qū)動因素

3.1 補償性進化 補償性進化是細菌為了改善自身適應性代價所發(fā)生的適應性突變，是避免耐藥菌株被敏感菌株輕易擊敗的關鍵因素[1]。補償性進化可以通過耐藥基因的突變積累來恢復耐藥菌的適應性。Yang等[20]研究發(fā)現(xiàn)，黏菌素耐藥基因mcr-3的2個變異體mcr-3.1和mcr-3.5之間僅存在3種氨基酸替換(M23V、A457V和T488I)，mcr-3.5通過積累的3個氨基酸的替換，改善了黏菌素耐藥基因的適應性。通過適當調(diào)控基因表達來調(diào)節(jié)耐藥的適應性代價可能對維持耐藥基因至關重要，也是可轉(zhuǎn)移耐藥質(zhì)粒傳播抗生素耐藥性的重要原因之一[3]。pKpQIL是在肺炎克雷伯菌ST258中發(fā)現(xiàn)并攜帶碳青霉烯類耐藥基因blaKPC的大型耐藥質(zhì)粒，研究發(fā)現(xiàn)，pKpQIL變體會對宿主細菌的代謝、運輸、信號轉(zhuǎn)錄等過程中的通路產(chǎn)生普遍的干擾，這些表達的變化可以補償質(zhì)粒對細胞的影響，從而降低質(zhì)粒的適應度代價[21]。

3.2 無適應性代價和適應性增加的耐藥突變 大多數(shù)耐藥突變的出現(xiàn)均會對菌體產(chǎn)生或大或小的適應性代價，但在腸桿菌科細菌進化的無數(shù)年歷史中，還是出現(xiàn)了罕見的無適應性代價和適應性增加的耐藥突變現(xiàn)象。研究發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌編碼核糖體S12蛋白的rpsL基因發(fā)生點突變(K42R)，導致了對鏈霉素產(chǎn)生耐藥性，突變株和野生株在體外和體內(nèi)進行競爭試驗，發(fā)現(xiàn)rpsL基因的突變僅僅在體外對大腸桿菌345-2 RifC有很小的適應性影響，而在體內(nèi)，rpsL基因的突變沒有帶來適應性代價[22]。大腸桿菌對氟喹諾酮類藥物的耐藥性是一個長期選擇進化的結(jié)果，研究發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌中有多達5個氟喹諾酮類耐藥突變的積累通常與適應性顯著降低有關，進化得到的耐藥突變體極大地提高了細菌的適應性，同時顯著地增加了抗生素耐藥性[23]。

3.3 遺傳連鎖和協(xié)同選擇 耐藥基因與其他耐藥基因或毒力基因的遺傳連鎖決定了它們的協(xié)同選擇[2]，通常意味著這2個或多個基因共處于1條染色體和同一個質(zhì)粒上，或者較小的遺傳單位，包括可移動的轉(zhuǎn)座子和捕獲外源基因的整合子。遺傳連鎖和協(xié)同選擇的可能結(jié)果是，一種抗生素的選擇會直接篩選出多重耐藥細菌[3]。遺傳連鎖和協(xié)同選擇促進了耐藥腸桿菌科細菌的流行和傳播[24]。大腸桿菌ST131、肺炎克雷伯菌ST258以及腸炎沙門氏菌DT104等流行性腸桿菌科病原菌能在全球占據(jù)主要地位的重要原因是它們的基因型將抗生素耐藥基因、毒力基因和傳播特性基因成功地整合到了一起，形成了一個具有高適應性的生物組合[25]。幾乎所有的大腸桿菌ST131都是多重耐藥菌，攜帶blaCTX-M-15的質(zhì)粒也在該譜系中穩(wěn)定下來，隨后在全球流行傳播[26]。肺炎克雷伯菌ST258攜帶的抗生素耐藥基因幾乎覆蓋了各種類型的抗生素，大多數(shù)都攜帶碳青霉烯類耐藥基因blaKPC[21]，部分ST258減少了孔蛋白的表達，導致細菌對黏菌素耐藥。目前已經(jīng)報道的NDM陽性腸桿菌科細菌尚無明顯的優(yōu)勢流行株，但blaNDM多數(shù)定位于質(zhì)粒上，blaNDM與其他抗生素耐藥基因的遺傳連鎖和協(xié)同選擇，是促進blaNDM持久性和快速傳播的重要原因[27-28]。

3.4 質(zhì)粒的進化和穩(wěn)定遺傳 作為遺傳連鎖和協(xié)同選擇最大的可移動元件，質(zhì)粒被認為是原核生物進化的主要驅(qū)動力，無論有無環(huán)境選擇壓力，攜帶有益宿主基因質(zhì)粒都會以一定的傳播頻率入侵到不同宿主菌群。在某些條件下(例如抗生素環(huán)境和重金屬環(huán)境)，質(zhì)粒可以編碼對宿主有益的基因，但質(zhì)粒對維持宿主基本的生存能力不是必需的，所以質(zhì)粒的存在往往會對宿主菌造成一定的適應性代價。如圖2所示，為確保攜帶有益基因質(zhì)粒的穩(wěn)定遺傳，宿主菌或質(zhì)粒的基因組通常會發(fā)生補償性進化，包括單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphism,SNPs)和大規(guī)模結(jié)構(gòu)的改變(插入、刪除、倒置和易位)，從而逐步達到穩(wěn)定遺傳的結(jié)果。質(zhì)粒自身也會編碼穩(wěn)定性機制，包括多聚體識別系統(tǒng)[29]、質(zhì)粒主動分區(qū)機制和質(zhì)粒成癮系統(tǒng)[4]。多聚體識別系統(tǒng)和主動分區(qū)機制確保了質(zhì)粒在子代的可靠遺傳[4]。質(zhì)粒成癮系統(tǒng)是質(zhì)粒編碼的特定的生存機制，包括限制修飾系統(tǒng)(Restriction modification system,RM)[30]和毒素抗毒素系統(tǒng)(Toxin-antitoxin-like system,TA)[31]，RM系統(tǒng)幫助質(zhì)粒越過宿主的RM系統(tǒng)的屏障，TA系統(tǒng)可以殺死沒有遺傳母代細胞完整質(zhì)粒結(jié)構(gòu)的子代細胞。有學者認為通過破壞質(zhì)粒穩(wěn)定性來消除質(zhì)粒可能是解決細菌多重耐藥的一種新的有效策略[30]。

圖2 質(zhì)粒的進化和穩(wěn)定遺傳

4 展望

由于腸桿菌科細菌的高度進化潛力，最初用于治療腸桿菌科細菌感染的抗生素的黃金時代正迅速轉(zhuǎn)向青銅時代。在腸桿菌科細菌耐藥性肆虐的今天，依靠耐藥性自身的適應性代價達到耐藥性的逆轉(zhuǎn)已經(jīng)成為了一種奢望。加強對腸桿菌科細菌特定耐藥基因[例如blaNDM、mcr和tet(X)]的適應性代價和補償性進化研究，將有助于更加全面地理解腸桿菌科細菌病原體抗生素耐藥性的發(fā)展軌跡，同時可以預測潛在病原體在接觸藥物后可能采取的進化路徑。適應性代價和補償性進化與環(huán)境因素有很強的相關性，因此需要使用動物模型對攜帶特定耐藥機制的病原菌的定植、競爭、傳播進行進一步的研究，以期找到影響特定耐藥基因和耐藥質(zhì)粒轉(zhuǎn)移和穩(wěn)定遺傳的關鍵基因。進一步可以利用不斷進步的基因組學、生理學和抗生素耐藥機制的知識，指導新型藥物和藥物靶點的選擇，通過破壞耐藥機制基因環(huán)境的穩(wěn)定性，或者將耐藥突變關聯(lián)到一個具有高的適應性代價和不易補償性進化的基因環(huán)境，從而在一定程度上限制腸桿菌科細菌耐藥性的傳播和進化趨勢。這些研究將為開發(fā)新的抗菌策略和治療藥物提供理論框架，為解決腸桿菌科細菌耐藥問題提供新的思路。