沒食子酸對高脂血癥小鼠的保護作用

郗艷麗 ， 趙峻秀 ， 陳 響 ， 譚振宇 ， 馮小雨 ， 馬洪波 , 趙洺琦

(吉林醫藥學院公共衛生學院，吉林 吉林 132103)

高脂血癥又稱脂代謝紊亂，可導致脂肪肝、心血管疾病、冠心病、胰腺炎及動脈粥樣硬化等疾病[1-3]，對患者生命健康產生威脅，臨床中較為重視高脂血癥及其引起的并發癥[4]，也廣泛開展了相關研究。目前市場上常用的他汀等降脂藥物，多為西藥，且有些藥物具有肝損害等不良反應[5]。開發天然低毒的降脂藥物，能給高脂血癥患者帶來福音。高脂血癥的發病機制與氧化應激損傷有關。沒食子酸(Gallic acid，GA)是我國傳統中藥五倍子、普洱、石榴、掌葉大黃、靈芝等中草藥植物的主要成分之一，是化學結構簡單且毒性小的天然多酚類化合物[6-7]，其具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、抗病毒、抗菌等多種生物活性，具備發展為新的降血脂藥物的潛力[8-9]。張旭等研究發現，沒食子酸對谷氨酸鈉誘導的肥胖小鼠有顯著的降脂作用，其能有效改善血清及肝臟中的總膽固醇(TC)和甘油三酯(TG)水平[10]。目前關于沒食子酸降脂作用機制的研究較少，其藥效和作用機制有待進一步研究。沒食子酸的毒性較低，生物安全性高[11]，是傳統中藥材中的常見成分，若能深入研究沒食子酸的降脂作用機制，可拓展沒食子酸的應用領域，提高傳統中藥材的利用價值和經濟價值。因此，本試驗以高脂血癥為研究對象，重點探討沒食子酸對脂肪乳誘導高脂血癥小鼠的保護作用，明確沒食子酸對高脂血癥小鼠的治療作用及其可能的作用機制，為臨床治療提供數據支持。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 沒食子酸(Gallic acid,Sigma公司)；膽固醇和脫氧膽酸鈉(國藥集團化學試劑有限公司)；吐溫80和1,2-丙二醇(天津市科密歐化學試劑有限公司)；豬油(自制)；護肝片(黑龍江葵花藥業股份有限公司)；丙氨酸氨基轉移酶(Alanine aminotransferase，ALT)、天冬氨酸氨基轉移酶(Aspartate aminotransferase，AST)、丙二醛(Malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)、一氧化氮(Nitric oxide，NO)、一氧化氮合酶(Nitric oxide synthase，NOS)、甘油三酯(Triglyceride，TG)、總膽固醇(Total cholesterol，TC)、高密度脂蛋白(High-density lipoprotein cholesterol，HDL-C)、低密度脂蛋白(Low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)和總蛋白測定試劑盒(南京建成生物工程公司)；血糖試紙(三諾生物傳感股份有限公司)。

1.2 主要儀器 SynergyH1M酶標儀(美國BioTek)；BS224S-CW電子分析天平(德國賽多利斯科技儀器)，NIU普通光學顯微鏡(日本尼康)，EG1150生物組織包埋機(德國Leica)，RM2245病理切片機(德國Leica)，T10組織分散機(德國IKA)；血糖儀(三諾)。

1.3 實驗動物 ICR小鼠，清潔級，體重18～22 g，購自長春億斯實驗動物技術有限公司，許可證號：SCXK(吉) 20180007。飼料，購自長春億斯實驗動物技術有限公司，許可證號：SCXK(吉)201901092。試驗前小鼠適應性飼養5 d。飼養條件：溫度18～22 ℃，濕度45%～65%，12 h明暗交替，自由飲水攝食。

1.4 試驗方法

1.4.1 脂肪乳的制備 30%豬油、10%膽固醇、10%吐溫80、20%1,2-丙二醇、3%脫氧膽酸鈉以及27%的水。制成高脂乳劑于4 ℃儲存，使用前37 ℃水浴加熱融化。

1.4.2 試驗分組與給藥 60只ICR小鼠，雌雄各半，按體重隨機區組[12]分為對照組、脂肪乳組、護肝片組、62.5 mg/(kg·bw)、125 mg/(kg·bw)和250 mg/(kg·bw)沒食子酸組。除對照組外，其余各組小鼠以20 mL/(kg·bw)脂肪乳劑連續灌胃8周。試驗第4周，除對照組和脂肪乳組外，護肝片組給予30 mg/(kg·bw)護肝片溶液灌胃，沒食子酸組分別給予62.5、125 mg/(kg·bw)和250 mg/(kg·bw)沒食子酸溶液灌胃，連續4周。末次給藥后，禁食不禁水24 h，眼球取血處死小鼠。取全血，置于4 ℃離心機中，3 000 r/min離心10 min，分離上清，置于-20 ℃冰箱保存。切取相同部位的肝臟組織固定于4%多聚甲醛溶液中，剩余組織凍存于液氮中，用于后續檢測。

1.4.3 血清中指標測定 取血清，按照試劑盒說明書步驟測定血清中ALT、AST、SOD、NOS、TG、TC、HDL-C和LDL-C的含量。取全血，血糖試紙測定小鼠血糖值。

1.4.4 肝組織中SOD、MDA、NO和NOS含量的測定 將肝小葉按1∶9(m/v)加入預冷的生理鹽水(pH 7.4)中，用眼科剪剪碎組織，置于組織破碎儀中勻漿，4 ℃ 4 000 r/min離心10 min，取上清液制成組織勻漿。按試劑盒說明書步驟測定肝組織勻漿中SOD、MDA、NO和NOS含量。

1.4.5 蘇木精-伊紅(H.E.)染色 將固定好的肝組織常規石蠟包埋，切片備用，H.E.染色后光學顯微鏡下觀察并拍照。

2 結果

2.1 情況觀察 各組小鼠的生長發育、活動均正常，未發現中毒死亡。

2.2 沒食子酸對各組小鼠血生化指標的影響 由表1可知，與對照組比較，脂肪乳組小鼠血清中ALT、AST、LDL-C、TC、TG和血糖水平顯著升高(P<0.05)。與脂肪乳組比較，護肝片組、沒食子酸各劑量組小鼠血清中ALT和TG含量顯著降低(P<0.05)；250 mg/(kg·bw)沒食子酸組小鼠血清中AST、LDL-C、TC含量顯著降低(P<0.05)；護肝片組、125 mg/(kg·bw)和250 mg/(kg·bw)沒食子酸組小鼠血清中血糖水平顯著降低(P<0.05)。與護肝片組比較，沒食子酸各劑量組小鼠血清中ALT含量顯著降低(P<0.05)；250 mg/(kg·bw)沒食子酸組小鼠血清中AST和LDL-C水平顯著降低(P<0.05)。與62.5 mg/(kg·bw)沒食子酸組比較，125 mg/(kg·bw)沒食子酸組小鼠血清中TG水平顯著降低(P<0.05)；250 mg/(kg·bw)沒食子酸組小鼠血清中AST、LDL-C和TG水平顯著降低(P<0.05)。與125 mg/(kg·bw)沒食子酸組比較，250 mg/(kg·bw)沒食子酸組小鼠血清中AST含量顯著降低(P<0.05)。

表1 沒食子酸對各組小鼠血生化指標的影響

2.3 沒食子酸對各組小鼠血清和肝臟中氧化應激標志物的影響 由表2可知，與對照組比較，脂肪乳組小鼠血清中SOD含量顯著降低、NOS含量顯著升高，肝組織中MDA和NO含量顯著升高、SOD含量顯著降低(P<0.05)。與脂肪乳組比較，護肝片組小鼠肝組織中SOD含量顯著升高，NOS含量顯著降低(P<0.05)；125 mg/(kg·bw)和250 mg/(kg·bw)沒食子酸組小鼠血清中NOS含量顯著降低，肝臟中NO含量顯著降低(P<0.05)；沒食子酸各劑量組小鼠肝組織中MDA和NO含量顯著降低(P<0.05)；250 mg/(kg·bw)沒食子酸組小鼠肝組織中NOS含量顯著降低(P<0.05)。與護肝片組比較，沒食子酸各劑量組小鼠肝組織中MDA和SOD含量顯著降低，62.5 mg/(kg·bw)和125 mg/(kg·bw)沒食子酸組小鼠肝組織中NOS含量顯著升高(P<0.05)。與62.5 mg/(kg·bw)和125 mg/(kg·bw)沒食子酸組比較，250 mg/(kg·bw)沒食子酸組小鼠肝組織中NOS含量顯著降低(P<0.05)。62.5、125 mg/(kg·bw)和250 mg/(kg·bw)沒食子酸組小鼠血清中SOD和NOS之間比較，無顯著差異(P>0.05)，肝組織中MDA、SOD和NO含量之間比較，也無顯著差異(P>0.05)。

表2 沒食子酸對各組小鼠血清和肝臟中氧化應激標志物的影響

2.4 病理組織學觀察 由圖1可知，各組肝組織經過H.E.染色后，對照組小鼠可見正常肝細胞結構，細胞核清晰可見，肝細胞圍繞中央靜脈呈放射狀整齊排列，形成細胞索，無顯著邊界分隔。脂肪乳組小鼠肝組織細胞邊界不清楚，細胞質可見空泡，部分細胞可見脂肪變性腫大，細胞核清晰可見，但分布偏離。可見大量炎性細胞浸潤。沒食子酸處理后，肝臟脂肪變性明顯減少，細胞腫脹程度減輕，細胞核位置處于正常狀態。

圖1 沒食子酸對小鼠肝組織的影響(H.E.染色，100×)

3 討論

高脂血癥是以TC、TG、LDL-C升高，HDL-C降低為主要臨床特征的一類疾病[13]，隨著人們生活水平的不斷提高，高脂血癥發病率逐年增高。目前，我國成年人中，血脂異常患病率可達40.40%[14]，高脂飲食是導致高脂血癥患病率不斷升高的重要因素[15]。本試驗發現，沒食子酸能顯著降低脂肪乳劑引起的血脂升高，能顯著降低TC、TG和LDL-C水平，改善HDL-C水平，對高脂血癥小鼠的血脂異常有一定的治療作用。相較于沒食子酸低、中劑量組，沒食子酸高劑量組對血脂的降低效果最顯著。

SOD是細胞內負責清除超氧陰離子自由基的重要抗氧化酶，是反映機體抗氧化能力的敏感指標[16]。MDA是多不飽和脂肪酸脂質過氧化作用的產物，是反應機體內脂質過氧化的重要指標之一[17]。NO是一種新型的自由基，在體內具有廣泛的生物活性[18]。NOS廣泛存在于人和哺乳動物的組織中，能催化底物L-精氨酸生成NO[19]。近年來研究發現，NO和NOS的升高與高脂血癥所致組織器官損傷密切相關[20]。國內外研究顯示，沒食子酸具有較好的抗氧化和清除自由基的作用。本試驗結果顯示，脂肪乳組血清中SOD水平顯著低于對照組，而沒食子酸高劑量組血清SOD水平顯著高于脂肪乳組，血清NOS水平顯著低于脂肪乳組。此時，血脂水平也恢復到接近正常水平。這些結果進一步證實了高脂血癥的發生與氧化應激有關，而沒食子酸對高脂血癥的治療作用與抗氧化酶活性增加以及自由基清除有關。

國內外有關學者的研究結果還發現，高脂血癥會導致肝組織病變并伴隨糖代謝紊亂，原因是高脂血癥患者氧化應激和脂質過氧化反應增強，多余脂肪沉積在肝組織，引起肝細胞變性或壞死，加重肝細胞脂質代謝紊亂。肝組織作為糖合成與分解的重要器官，當肝組織出現損害以及脂代謝紊亂時，會導致糖代謝也出現紊亂[21-22]。血清中的ALT和AST水平與肝細胞損害程度呈正相關，是反映肝細胞發生損害的敏感標志物[23]。本試驗中發現，脂肪乳組小鼠血清中的ALT和AST水平顯著升高，這表明小鼠給予高脂飲食后，肝組織因脂肪堆積而發生了損傷。而沒食子酸能顯著降低血清中ALT和AST水平，能顯著減輕脂肪乳劑導致的肝臟組織損傷。在沒食子酸高劑量組中，小鼠肝組織SOD水平顯著升高，MDA水平顯著降低，NO和NOS水平顯著降低。這提示，沒食子酸能通過調節氧化酶活性并降低脂質過氧化損傷作用，進而維持氧化和抗氧化之間的平衡，改善小鼠肝組織的氧化損傷程度。小鼠肝組織病理學檢測結果進一步證實了沒食子酸對脂肪乳劑引起的肝組織炎性反應和脂肪變性有改善作用。此外，給予沒食子酸后，血清中的血糖水平也明顯下降，這提示沒食子酸對糖脂代謝紊亂都有改善作用。這些結果表明沒食子酸能通過調節肝組織功能，降低血脂和血糖水平，改善糖脂代謝紊亂。

綜上所述，沒食子酸增強了小鼠的抗氧化活性，在降低血脂水平的同時能改善脂肪乳劑引起的肝組織病理改變和肝功能損傷。沒食子酸可以作為治療和預防糖脂代謝紊亂、心腦血管疾病、動脈粥樣硬化的理想候選藥物。