蘭香草水煎液急性毒性試驗和止血抗炎鎮痛作用

陳美安 ， 莫曉方 ， 吳小燕

(廣西中醫藥大學藥學院，廣西 南寧 530001)

蘭香草為馬鞭草科蕕屬植物蘭香草[Caryopterisincana(Thunb.) Miq.]的全草或帶根全草，具有疏風解表、祛寒除濕、散瘀止痛等功效，可用于治療風寒感冒、百日咳、慢性支氣管炎、肝炎、胃腸炎、外傷出血及產后瘀血等疾病[1-4]。本課題組前期研究發現，蘭香草70%乙醇提取物的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和余下水部位均具有較好的抗炎活性[5]。另外，蘭香草水提取液中可能含有鞣質、有機酸、糖類、苷類、蛋白質和多肽類等多種類型成分[6]。現代藥理研究表明，蘭香草具有抗菌、鎮咳、祛痰、保肝、抗氧化、抑制α-葡萄糖苷酶等生物活性[7-12]。因此，本試驗以蘭香草為研究對象，考察其水煎液的急性毒性及止血、抗炎、鎮痛作用，為該藥材在中醫及獸醫臨床的應用提供理論依據，并為其合理開發利用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康昆明系小鼠，SPF級，體重為18～22 g，雌雄不限，購自湖南斯克景達實驗動物有限公司，實驗動物生產許可證為SCXK(湘)2016—0002。

1.2 藥物與試劑 蘭香草藥材，采自廣西河池，經廣西中醫藥大學朱意麟實驗師鑒定為馬鞭草科蕕屬植物蘭香草[Caryopterisincana(Thunb.) Miq.]的干燥全草，陰干，備用。云南白藥(云南白藥集團股份有限公司，批號：ZMA1605)；醋酸地塞米松片(浙江仙琚制藥股份有限公司，批號：151011)；阿司匹林腸溶片(湖南新匯制藥有限公司，批號：170406)；冰醋酸(國藥集團化學試劑有限公司，批號：20121212)；二甲苯(國藥集團化學試劑有限公司，批號：F20060419)；角叉菜膠(上海如吉生物科技發展有限公司，批號：160411)；水為蒸餾水；其余化學試劑均為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.3 儀器與設備 AJ150電子分析天平(瑞士梅特勒-托利多集團)；UV-1780紫外可見分光光度計(島津儀器蘇州有限公司)；RB-200智能熱板儀(成都泰盟軟件有限公司)；TGL-166離心機(上海安亭科學儀器廠)；HH-S 恒溫水浴鍋(江蘇金壇市醫療儀器廠)。

1.4 蘭香草水煎液的制備 將蘭香草藥材粉碎成粗粉，取藥材粗粉2 500 g，加入10倍量水，浸泡1.0 h后，煎煮3次，每次煎煮1.0 h，過濾，合并3次濾液，濃縮至500 mL，得濃度為5 g生藥/mL的蘭香草水煎液，密封冷藏，備用。

1.5 急性毒性試驗 根據參考文獻[13]，取60只小鼠，雌雄各半，隨機分為6個組，每組10只，給藥前禁食不禁水12 h，根據預試驗，確定引起0%動物死亡的最小劑量(Dn)和100%動物死亡的最大劑量(Dm)的致死量范圍。在此范圍內，組間劑量比值按1∶0.8進行試驗，各組的劑量分別為65.60、82.00、102.40、128.00、160.00、200.00 g生藥/(kg·bw)，以最大限度0.4 mL/(10 g·bw)灌胃給藥1次后，自由飲食，連續觀察14 d，記錄小鼠活動情況及毒性反應情況，并對死亡小鼠尸體進行剖檢，觀察其內臟器官的變化情況。采用改良寇氏法計算小鼠的半數致死量(LD50)和95%置信區間。

1.6 止血試驗

1.6.1 對小鼠凝血時間(CT)的影響 根據參考文獻[13-14]，取50只小鼠，雌雄各半，隨機分為5個組，每組10只，即空白對照組(等體積的生理鹽水)、陽性對照組[云南白藥0.33 g/(kg·bw)]、蘭香草水煎液高劑量組[25.6 g生藥/(kg·bw)]、蘭香草水煎液中劑量組[12.8 g生藥/(kg·bw)]、蘭香草水煎液低劑量組[6.4 g生藥/(kg·bw)]，各組每日灌胃給藥1次，給藥容積為0.2 mL/(10 g·bw)，連續灌胃7 d。末次給藥1 h后，用內徑為0.9～1.1 mm、厚度為0.10～0.15 mm的毛細管從小鼠眼內眥部刺入，使血液自行流出，棄去第1滴血，再分別將血液滴于清潔載玻片的兩端，血滴直徑5 mm，立即開始計時，此后每隔30 s用干燥針頭挑動血液1次，至針頭能挑起纖維蛋白絲為止。從采血開始至挑起血絲止，所歷時間即為凝血時間(CT)。凝血時間縮短率/%=(空白對照組平均凝血時間-給藥組平均凝血時間)/空白對照組平均凝血時間×100%。

1.6.2 對小鼠出血時間(BT)的影響 根據參考文獻[13-14]，按照“1.6.1”項的分組及給藥方法。末次給藥1 h 后，于小鼠尾尖約 3 mm處標記，用手術刀片在鼠尾標記處橫向切斷，待血液自行溢出時開始計時，每隔30 s用濾紙吸去血滴1次，直至血液自然停止為止，所歷時間即為出血時間(BT)。出血時間縮短率/%=(空白對照組平均出血時間-給藥組平均出血時間)/空白對照組平均出血時間×100%。

1.7 抗炎試驗

1.7.1 對二甲苯致小鼠耳腫脹的影響 根據參考文獻[13，15-16]，按照“1.6.1”項的分組及給藥方法，以地塞米松[5.0 mg/(kg·bw)]為陽性對照組。末次給藥45 min 后，于小鼠右耳正反兩面滴二甲苯20 μL/只致炎，致炎15 min 后處死小鼠，于左右耳相同的部位用8 mm打孔器打下圓耳片，精密稱重，左右耳片的重量差為耳腫脹度。耳腫脹抑制率/%=(空白對照組平均腫脹度-給藥組平均腫脹度)/空白對照組平均腫脹度×100%。

1.7.2 對角叉菜膠致小鼠足跖腫脹的影響 根據參考文獻[13，15]，按照“1.6.1”項的分組及給藥方法，以地塞米松[5 mg/(kg·bw)]為陽性對照組。末次給藥1 h后，每只小鼠右足跖皮下注射1%角叉菜膠0.05 mL，4 h后沿踝關節切下左右足，精密稱重，左右足的重量差為足跖腫脹度。足跖腫脹抑制率/%=(空白對照組平均腫脹度-給藥組平均腫脹度)/空白對照組平均腫脹度×100%。

1.8 鎮痛試驗

1.8.1 對小鼠熱板致痛反應的影響 根據文獻[14-15,17]，將小鼠置于(55±0.5)℃的智能熱板儀上，記錄小鼠足底接觸熱板至出現舔后足所需時間，即為該小鼠痛閾值。篩選痛閾值在5～30 s的合格小鼠40只，每組8只，按照“1.6.1”項的分組及給藥方法，以阿司匹林[0.5 g/(kg·bw)]為陽性對照組。于給藥前測定各組小鼠正常痛閾值作為給藥前痛閾值，于末次給藥1 h后測定小鼠舔后足時間為給藥后痛閾值。痛閾提高率/%=(給藥后平均痛閾值-給藥前平均痛閾值)/給藥前平均痛閾值×100%。

1.8.2 對醋酸致小鼠扭體反應的影響 根據參考文獻[15,17]，按照“1.6.1”項的分組及給藥方法，以阿司匹林[0.5 g/(kg·bw)]為陽性對照組。末次給藥1 h后，每組小鼠腹腔注射 0.6% 醋酸溶液10 mL/(kg·bw)。觀察并記錄小鼠注射冰醋酸后15 min內扭體反應次數。扭體抑制率/%=(空白對照組平均扭體次數-給藥組平均扭體次數)/空白對照組平均扭體次數×100%。

2 結果

2.1 蘭香草水煎液的急性毒性試驗 小鼠灌胃給藥1 d后，部分出現反胃、進食減少、自主活動減少、蜷曲、呼吸減慢等癥狀，無小鼠死亡。第2天后小鼠陸續出現死亡，14 d后無小鼠死亡。死亡小鼠剖檢觀察心、肝、脾、肺、腎、胃腸等內臟器官，未見出血、壞死等病變。根據改良寇氏法計算，蘭香草水煎液的LD50=126.73 g生藥/(kg·bw)，LD50的95%置信區間為117.39～136.07 g生藥/(kg·bw)，結果見表1。

表1 急性毒性檢測

2.2 對小鼠凝血時間(CT)的影響 結果如表2所示，與空白對照組比較，蘭香草水煎液高、中、低劑量組均能顯著縮短小鼠凝血時間(P<0.01)。其中，低劑量組的效果略優于高、中劑量組。

表2 小鼠凝血時間(CT)檢測

2.3 對小鼠出血時間(BT)的影響 結果如表3所示，與空白對照組比較，蘭香草水煎液高、中、低劑量組均能顯著縮短小鼠出血時間(P<0.01)。其中，中劑量組效果優于陽性對照組和高、低劑量組。

表3 小鼠出血時間(BT)檢測

2.4 對二甲苯致小鼠耳腫脹的影響 結果如表4所示，與空白對照組比較，蘭香草水煎液高、中、低劑量組均能顯著降低二甲苯所致小鼠耳腫脹程度(P<0.05或P<0.01)，且存在明顯的量效關系，即給藥劑量越大，作用越強。其中，高劑量組的腫脹抑制率稍優于陽性對照組。

表4 二甲苯致小鼠耳腫脹檢測

2.5 對角叉菜膠致小鼠足跖腫脹的影響 結果如表5所示，與空白對照組比較，蘭香草水煎液高劑量組能顯著降低由角叉菜膠所致小鼠足跖腫脹程度(P<0.01)，且蘭香草水煎液各劑量組間存在明顯的量效關系。其中，高劑量組的腫脹抑制率高于陽性對照組。

表5 小鼠足趾腫脹檢測

2.6 對小鼠熱板致痛反應的影響 結果如表6所示，與空白對照組比較，蘭香草水煎液高劑量組能顯著降低小鼠熱板致痛反應(P<0.05)，且蘭香草水煎液各劑量組間存在明顯的量效關系。

表6 小鼠熱板致痛反應試驗結果

2.7 對醋酸致小鼠扭體反應的影響 結果如表7所示，與空白對照組比較，蘭香草水煎液高、中、低劑量組能顯著減少醋酸致小鼠扭體次數(P<0.05或P<0.01)，且存在明顯的量效關系。

表7 小鼠扭體反應試驗結果

3 討論

目前，有關蘭香草及其復方制劑的相關研究報道甚少，尤其是藥理研究方面。因此，本試驗對蘭香草水煎液進行急性毒性反應以及止血、抗炎、鎮痛活性研究。在急性毒性試驗中，通過測定蘭香草水煎液的LD50，篩選出安全、有效劑量，為其臨床安全用藥提供科學依據。試驗結果顯示，蘭香草水煎液的LD50為126.73 g生藥/(kg·bw)，根據其LD50可確定止血、抗炎、鎮痛試驗的給藥劑量，其中，高劑量取LD50的1/5，中劑量取LD50的1/10，低劑量取LD50的1/20，在一定劑量范圍內研究該藥材的止血、抗炎、鎮痛作用是安全有效的。

機體正常止血與凝血機制與血管壁、血小板、凝血因子、抗凝因子、纖溶系統及其相互之間的生理性調節和平衡息息相關。在止血試驗中，通過玻片法測定小鼠凝血時間和斷尾法測定小鼠出血時間來評價蘭香草水煎液的止血活性。結果表明，蘭香草水煎液可顯著縮短小鼠凝血時間和出血時間，但不存在劑量依賴關系；在凝血時間測定中發現，低劑量組要略優于高、中劑量組，而出血時間測定中發現，中劑量組優于陽性對照組(云南白藥)和高、低劑量組。

急性炎癥或炎癥早期主要表現是毛細血管擴張、通透性亢進、滲出和水腫，本試驗通過二甲苯所致小鼠耳廓腫脹和角叉菜膠所致小鼠足腫脹建立2種常用的急性炎癥模型。結果表明，蘭香草水煎液可顯著抑制致炎物質誘發的急性炎癥反應，高劑量組優于陽性對照組(地塞米松)，且作用效果與劑量呈正相關。

機體在受到內、外環境刺激后，致痛物質(比如緩激肽、組胺、前列腺素等)從組織中產生并釋放，興奮傷害疼痛感受器或使其致敏，導致疼痛。本試驗采用小鼠熱板致痛法和醋酸致扭體法2種常用致痛模型測定鎮痛活性。結果表明，蘭香草水煎液可明顯減輕小鼠疼痛反應，且作用效果與劑量呈正相關。另外，筆者曾采用吲哚美辛作為陽性對照藥，發現給藥后小鼠逐漸消瘦死亡，預試驗結果亦不理想。之后改用阿司匹林，給藥后小鼠飲食、活動、體重等方面均正常，且鎮痛效果明顯。故最終選用阿司匹林作為陽性對照藥。

綜上，蘭香草水煎液毒性小，具有較好的止血、抗炎、鎮痛作用。但其發揮藥效的物質基礎及作用機理尚不明確，有待進一步研究。