滲濕降濁方對非酒精性脂肪性肝病大鼠脂代謝及AMPK/PPAR-α信號通路的影響

許 錚 ， 吳凡偉 , 牛 璇 , 盧曉鵬

(1.廣州中醫藥大學 ， 廣東 廣州 510006 ； 2.深圳市寶安區中醫院 ， 廣東 深圳 518000)

非酒精性脂肪性肝病(Nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)是指除長期大量飲酒和其他明確的肝損傷因素所引起的，以甘油三酯為主的脂質在肝細胞中蓄積為病理改變的肝臟代謝性疾病[1]。流行病學調查表明，歐美地區 NAFLD 的發病率在20%以上，我國發病率已達15%[2-3]。約1/3的非酒精性單純性脂肪肝患者會發展為非酒精性脂肪性肝炎，并導致肝病相關的疾病和死亡[4]。目前其發病機制不明，有研究顯示，NAFLD是一種與胰島素抵抗和遺傳易感相關的代謝應激性肝損傷，肝內大量游離脂肪酸的累積，使脂蛋白合成與分泌障礙，導致肝細胞發生脂肪性變性，引起該病的發生[5-6]。因此，改善機體脂代謝功能是治療NAFLD的關鍵。研究證實，中藥在調節血脂、改善脂質代謝等方面具有良好前景，并成為臨床治療NAFLD的重要手段[7-9]。本試驗采用高脂高糖飼料喂養大鼠建立NAFLD模型，并以滲濕降濁方進行干預，觀察脂代謝情況并分析其作用機制，為滲濕降濁方的臨床運用及進一步研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要藥材與試劑 滲濕降濁方：蒼術10 g、茯苓15 g、厚樸10 g、法半夏15 g、滑石15 g、通草10 g、柴胡15 g、枳實10 g、赤芍10 g、三七10 g、茜草10 g和楮實子30 g，均由深圳市寶安區中醫院藥房提供，用法用量：煎煮，每次加6倍量水，煎50 min，制備成濃度為0.6 g/mL煎液，備用。陽性對照藥物易善復(YSF)，即多烯磷脂酰膽堿膠囊，購自賽諾菲(北京)制藥有限公司(批號：H20059010)；血清AMPK、PPAR-α ELISA檢測試劑盒(批號：JL45405、JL11365)，均購自江萊生物科技有限公司；兔抗大鼠AMPK單克隆抗體、兔抗大鼠PPAR-α 多克隆抗體(批號：ab215270、ab32047)，均購自英國Abcam公司；即用型高效免疫組化二抗試劑盒(批號：UNIV-IHC-0001)，購自優寧維生物技術公司。

1.2 主要儀器 酶標儀(型號：EONC，基因有限公司)；全自動生化分析儀(TBA-40FR，日本東芝公司)；H.E.染色儀(型號：ST5020，Leica公司)；脫水機(型號：Pathcentre，Thermo公司)；包埋機(型號：Histostar，Thermo公司)；石蠟切片機(型號：RM2245，Leica公司)；顯微鏡(型號：BX61，Olympus公司)。

1.3 實驗動物 36只7～8周齡雄性SPF級SD大鼠，體重(250±20)g，購自南方醫科大學實驗動物中心(動物合格證編號：44002100019096)。動物室內環境溫度(21±1)℃，濕度(50±15)%，12 h明暗交替。

1.4 方法

1.4.1 NAFLD大鼠模型的建立 采用高脂高糖飼料進行模型制備，配方：蔗糖20.0%、豬油15.0%、膽固醇1.2%、膽酸鈉0.2%、酪蛋白10.0%、磷酸氫鈣0.6%、石粉0.4%、預混料0.4%、基礎飼料52.2%，由廣東省醫學實驗動物中心配置，連續喂養4周。造模成功標準：肉眼可見肝葉鋒利的邊緣消失，表面包膜緊張，顏色變淺、整體發黃并可見斑點狀花紋；觸摸時其硬度如泥塊，并有油性分泌物；光鏡下可見干細胞呈彌漫性脂肪變性，且出現水腫，部分可見壞死。

1.4.2 分組與干預 將造模成功的SD大鼠隨機分為模型組[灌服生理鹽水10 mL/(kg·bw)]，滲濕降濁方高、中、低劑量組[滲濕降濁方灌胃10、5 g/(kg·bw)和2.5 g/(kg·bw)],西藥組[多烯磷脂酰膽堿混懸液灌胃1.2 g/(kg·bw)],每組各6只；同批飼養健康SD大鼠6只為空白對照組(不造模，灌服生理鹽水)；1次/d，連續4周，每組給藥容量均為10 mL/(kg·bw)。

1.4.3 觀察指標 (1)肝質量、肝指數檢測：對大鼠干預4周后稱重，麻醉后取肝組織，濾紙吸干肝組織上的體液后稱重，記錄肝質量，計算肝指數(肝指數=肝質量/體質量×100%)，比較各組肝質量及肝指數大小。(2)肝組織病理學變化(光鏡觀察)：取肝中葉做病理組織學檢查，4%多聚甲醛固定，脫水、包埋后做石蠟切片，常規蘇木精-伊紅(H.E.)染色，光鏡下觀察各組肝臟組織學變化特點。(3)血脂指標檢測：各組大鼠腹主動脈采血，3 000 r/min離心15 min，分離血清，全自動生化分析儀檢測各組大鼠血清中總膽固醇(Total cholesterol,TC)、三酰甘油(Triacylglycerol,TG)、高密度脂蛋白(High-density lipoprotein,HDL)和低密度脂蛋白(Low-density lipoprotein,LDL)的含量。(4)血清中AMPK、PPAR-α含量的檢測：各組大鼠血清按照ELISA試劑盒說明書檢測AMPK、PPAR-α的含量。(5)免疫組化法檢測肝組織中AMPK、PPAR-α蛋白表達變化：二甲苯和梯度酒精對組織切片進行脫蠟、水化，0.3%的過氧化氫室溫孵育10 min去除過氧化物酶，加超級封閉液孵育5 min以減少非特異性染色，一抗AMPK稀釋濃度為1∶100，PPAR-α為1∶250。二抗孵育參照試劑盒說明書進行操作。DAB顯色，蘇木精復染、脫水、透明、中性樹膠封片。采用Image pro plus 6.0圖像分析系統測量積分光密度(IOD)值。

2 結果

2.1 肝質量與肝指數比較 與空白對照組比較，模型組大鼠肝質量、肝指數極顯著增高(P<0.01)；與模型組相比，滲濕降濁方高、中劑量組肝質量，滲濕降濁方高劑量組肝指數極顯著降低(P<0.01)(表1)。

表1 各組大鼠肝質量與肝指數比較

2.2 肝臟病理學分析 H.E.染色可見：空白對照組大鼠肝小葉結構完整、清晰；中央靜脈大，管壁薄，肝索呈放射狀分布其周圍且排列整齊，肝竇清晰可見；肝細胞呈多邊形且大小較一致，核結構清晰可見，細胞內少有脂質沉積。模型組大鼠肝組織可見重度彌漫性、肝細胞大泡性脂肪變性，肝細胞腫脹，呈明顯氣球樣變，部分小葉可見壞死灶，匯管區可見明顯的炎性細胞浸潤，并向小葉內延伸，部分樣本有明顯的炎性細胞浸潤聚集。滲濕降濁方高、中、低劑量組和西藥組大鼠肝組織也可見不同程度彌漫性肝細胞脂肪變，但其程度和炎癥浸潤較模型組呈不同程度減少，其中高劑量組改善程度最為明顯(圖1)。

圖1 各組大鼠肝組織的病理改變(H.E.染色,200×)

2.3 血清中血脂含量比較 血脂含量檢測結果顯示，與空白對照組相比，模型組大鼠血清中TC、TG、LDL含量均極顯著升高(P<0.01)，HDL含量極顯著降低(P<0.01)。與模型組比較，滲濕降濁方高、中、低劑量組和西藥組血清中TC、TG、LDL含量均極顯著降低(P<0.01)，HDL含量極顯著增高(P<0.01)，且呈現劑量依賴性。與西藥組相比，滲濕降濁方高、中、低劑量組血清TG、LDL含量，滲濕降濁方高、中劑量組血清TC含量均明顯降低(P<0.05或P<0.01)，滲濕降濁方低劑量組血清TC含量無明顯變化(P>0.05)(表2)。

表2 滲濕降濁方對大鼠血清中TC、TG、HDL、LDL含量變化的影響

2.4 血清中AMPK、PPAR-α含量比較 與空白對照組相比，模型組血清AMPK、PPAR-α含量極顯著降低(P<0.01)；與模型組相比，滲濕降濁方高、中、低劑量組和西藥組AMPK含量，滲濕降濁方高、中劑量組和西藥組PPAR-α含量極顯著增高(P<0.01)，滲濕降濁方低劑量組血清PPAR-α含量無統計學意義(P>0.05)。與西藥組相比，滲濕降濁方高、中、低劑量組血清AMPK含量和滲濕降濁方高、中劑量組PPAR-α含量極顯著增高(P<0.01)，滲濕降濁方低劑量組血清PPAR-α含量無顯著性差異(P>0.05)。提示滲濕降濁方能夠顯著提高非酒精性脂肪性肝病大鼠血清AMPK、PPAR-α的含量(表3)。

表3 滲濕降濁方對大鼠血清中AMPK、PPAR-α含量變化的影響

2.5 肝臟AMPK、PPAR-α蛋白表達比較 與空白對照組相比，模型組AMPK、PPAR-α蛋白表達極顯著降低(P<0.01)；與模型組相比，滲濕降濁方高、中、低劑量組和西藥組AMPK蛋白表達，滲濕降濁方高、中劑量組PPAR-α蛋白表達極顯著增高(P<0.01)，滲濕降濁方低劑量組、西藥組PPAR-α蛋白表達無統計學意義(P>0.05)。與西藥組相比，滲濕降濁方高、中、低劑量組AMPK及滲濕降濁方高、中劑量組PPAR-α蛋白表達顯著增高(P<0.01或P<0.05)，滲濕降濁方低劑量組PPAR-α蛋白表達無顯著性差異(P>0.05)(表4)。

表4 滲濕降濁方對大鼠肝臟AMPK、PPAR-α表達水平的影響

3 討論

盡管對NAFLD發病機制仍存在爭議，但多數學者更認同“二次打擊”學說[10-11]，認為非酒精性脂肪性肝病的發病與胰島素抵抗密切相關，胰島素抵抗是其發生發展的核心環節，脂質代謝異常是始動因子。機體通過何種方式調節肝臟脂肪細胞因子的表達水平，增強胰島素與受體結合，提高胰島素敏感性，改善胰島素抵抗，降低脂質在肝臟的蓄積，成為目前研究的熱點[12]。

滲濕降濁方為清末民初河南名醫陳其昌的經驗方，具有滲濕和里、活血化瘀、行氣降濁之功效。前期臨床研究表明，該方在治療非酒精性脂肪性肝病方面具有一定療效，具有改善肝功能、降低血脂的作用[13]。本試驗成功建立非酒精性脂肪性肝病大鼠模型，經4周滲濕降濁方干預后，各滲濕降濁方組肝質量及肝指數較模型組顯著降低，隨著給藥劑量的增加，肝組織細胞排列逐漸緊密，脂滴數亦相應減少，說明滲濕降濁方對NAFLD起到較好的治療效果。另外，滲濕降濁方通過降低血清TC、TG和LDL含量及增高HDL含量發揮降脂作用。

AMPK作為細胞能量和氧化還原狀態的傳感器，是脂肪酸β氧化的關鍵酶，激活AMPK可增強脂肪分解而產生ATP，減弱同化作用以抑制消耗，可以抵抗氧化應激和增加脂肪酸利用率并抑制肝臟脂質合成[14-15]。同時AMPK通過磷酸化以增強下游線粒體的功能，提高能量代謝率，抑制脂肪合成，減少脂質沉積[16]。研究表明，AMPK通過改善胰島素抵抗、調節NF-κB活性間接抑制肝臟炎癥反應、促進脂聯素高聚體的合成，提高葡萄糖耐受性和胰島素敏感性，從而減輕肝損傷、抑制NAFLD的發展[17-21]。本試驗中，NAFLD大鼠AMPK表達量明顯降低，而滲濕降濁方能有效提高其血清含量及肝臟組織蛋白表達，提示滲濕降濁方對NAFLD肝臟的保護作用可能是通過AMPK介導的信號通路實現。

PPAR-α是參與過氧化物酶體和線粒體β-氧化、脂肪酸轉運和肝葡萄糖生成的轉錄調節因子，肝臟特異性敲除PPAR-α會破壞肝臟和全身脂肪酸的平衡及誘發NAFLD和高膽固醇血癥[22]。上調PPAR-α能抑制促炎因子的生成和肝細胞炎癥的發生，減輕肝纖維化[23]。本試驗發現，滲濕降濁方干預可以誘導NAFLD大鼠PPAR-α蛋白表達增高，減少肝細胞脂肪病變。

綜上所述，本試驗初步證實滲濕降濁方對非酒精性脂肪性肝病大鼠具有一定的治療作用，其作用機制可能與激活AMPK/PPAR-α信號通路，減輕內質網應激引起的炎癥反應，加快脂質代謝有關。