復方白頭翁散對鵝源鼠傷寒沙門菌分離株的體外抑制效果

王彥紅 ， 高 尚 ， 王麗揚 ， 陳素娟 ， 許小琴

(1. 揚州大學獸醫學院 ， 江蘇 揚州 225009 ； 2.江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協同創新中心 ， 江蘇 揚州 225009 ； 3.江蘇省人獸共患病學重點實驗室 ，江蘇 揚州 225009)

沙門菌是一種重要的人獸共患病原菌，不僅給人類健康帶來了威脅，也給養禽業造成了巨大的經濟損失。家禽在生產過程中，由于應用大量抗生素和化學性抗菌藥物來預防和控制沙門菌病，造成了嚴重的細菌耐藥性和禽蛋肉產品中的藥物殘留，越來越多的沙門菌已成為多重耐藥菌[1-3]，多重耐藥菌株的產生最終將危害人類的健康。此外，生物被膜增加細菌在外界環境中的生存能力，提高細菌耐藥性及致病性[2]，增加食品污染的機會，成為人類沙門菌病暴發的重要原因。我國是養禽大國，多年的細菌流行病學調查試驗數據顯示，水禽中流行的沙門菌的優勢血清型是鼠傷寒沙門菌，這些菌株具有較強的生物被膜形成能力[4]。

近年來，采用植物性藥物控制沙門菌成為研究熱點，如山奈酚可抑制鼠傷寒沙門菌的致病性作用[5]，黃連素能抑制鼠傷寒沙門菌生物被膜的形成[6]。臨床實踐發現，包含多種成分組合方劑的治療效果遠遠優于單種成分的方劑[7]。經典方如白頭翁湯(Pulsatilla decoction，PD)最早見于張仲景的《傷寒論》，至今白頭翁散仍是《中華人民共和國獸藥典》(2015年版)收載的方劑。白頭翁湯包含白頭翁、黃連、黃柏和秦皮，這4種藥物都具有抗細菌的活性成分，對大腸埃希菌和沙門菌等感染都具有良好的治療效果[8-10]。有研究發現，黃芩抗菌性比黃連好，且不產生抗藥性，主要成分黃芩苷能抑制細菌毒力和提高機體免疫應答能力，進而提高小鼠抗鼠傷寒沙門菌感染的能力，而且藥物組方不同，效果具有差異性[8,11]。本試驗所用復方白頭翁散，在多年臨床實踐中有較好的效果。因此，本試驗對送檢鵝源病例進行沙門菌分離，調查該菌的流行情況、耐藥性和生物被膜形成能力，檢測復方白頭翁散對臨床鵝源鼠傷寒沙門菌分離株的抑菌效果和抑制生物被膜形成能力，為臨床使用該方劑提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 主要材料 胰蛋白胨和酵母粉，均購自英國OXOID公司；瓊脂糖和核酸I型染液，均購自北京索萊寶科技有限公司；Taq酶和100 bp DNA Ladder等，均購自日本TaKaRa公司；緩沖蛋白胨水(BPW)，購自北京陸橋技術有限責任公司；法國科瑪嘉顯色培養基，購自上海欣中生物有限公司；抗菌藥敏紙片和氯化鎂孔雀綠(MM)增菌液，均購自杭州微生物試劑有限公司；沙門菌屬診斷血清，購自寧波天潤生物藥業有限公司。

1.2 沙門菌的分離 2017年5月—2018年7月對各地送檢至揚州大學動物醫院的病例進行采樣，臨床樣品中采集病死鵝的肝臟、膽汁和盲腸，加入BPW中，37 ℃培養18 h，再吸取BPW混合液50 μL，滴在MM固體培養基上，37 ℃培養24 h，挑取單個菌落，接種于法國科瑪嘉顯色培養基上，37 ℃培養24 h，挑取粉紅色菌落，接種于麥康凱培養基(MAC)上進行純培養。

1.3 沙門菌的PCR鑒定 將1.2中初步篩選的沙門菌疑似菌株采用高溫裂解法提取細菌DNA，于-20 ℃凍存。按照國家標準《飼料中沙門氏菌的快速檢測方法聚合酶鏈式反應(PCR)法》(GB/T 28642—2012)，以invA為鑒定基因進行PCR擴增。引物P1:TCGCACCGTCAAAGGAACCGTAAAGC，P2:GCATTATCGATCAGTACCAGCCGTCT，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。invA基因預期目的條帶大小為330 bp，擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳，觀察結果。

1.4 血清型鑒定 采用玻片凝集法鑒定沙門菌血清型。先用沙門菌A～F群多價O抗原血清進行檢測，然后用H抗原多價血清檢測，分群后再用單因子的O抗原和H抗原血清檢測。

1.5 藥敏試驗 選擇18種藥物，采用紙片擴散法檢測藥物敏感性，藥敏試驗判斷標準參照美國臨床實驗室標準化委員會(CLSI，2013年)。

1.6 鵝源鼠傷寒沙門菌生物被膜形成檢測 參照參考文獻[12]，采用96孔板結晶紫染色法檢測生物被膜形成能力。使用鼠傷寒沙門菌標準株(S162)和臨床分離菌制備菌懸液，每株菌株接種4孔，設置陰性對照。28 ℃培養72 h，棄上清液，PBS沖洗3次。0.4%結晶紫染色，33%冰乙酸洗脫生物被膜，測定550 nm處的吸光值，每株菌進行4次平行試驗，取平均值，判定生物被膜形成能力。

1.7 復方白頭翁散的組成與制備 復方白頭翁散由5份白頭翁、3份黃柏、4份秦皮、3份黃芩、8份連翹、3份苦參和5份甘草組成，混合打粉，再制成1.5 g/mL濃度的白頭翁湯，4 ℃保存備用。

1.8 復方白頭翁散最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)的測定 藥液用LB培養液連續倍比稀釋至1 500～2.93 mg/mL，96孔板每孔加入100 μL，相應孔加入鼠傷寒沙門菌株菌液100 μL，加入200 μL未加中藥的無菌培養液和菌液分別作為陰性對照和陽性對照，設3個重復。37 ℃孵育24 h，檢測MIC和MBC。

1.9 生物被膜形成體外抑制試驗 將能夠形成生物被膜的鼠傷寒沙門菌株的菌液100 μL接種到96孔板中，設3個重復，另加入100 μL倍比稀釋的復方白頭翁散(1 500～23.44 mg/mL)。加入200 μL未加中藥的無菌培養液和菌液分別作為陰性對照和陽性對照，采用1.6中結晶紫染色法進行檢測。

1.10 統計分析 采用IBM SPSS Statistics 22軟件卡方檢驗分析，以P<0.05作為差異是否顯著的判斷標準。

2 結果

2.1 沙門菌的分離與鑒定 2017年5月—2018年7月，從臨床采集患病鵝肝臟、膽汁和盲腸內容物共214份。通過細菌分離，分離菌DNA經沙門菌invA基因的PCR擴增，擴增產物經電泳，有50株分離菌株出現330 bp 目的條帶，陽性率為23.4%。如表1所示，采集的樣品中以揚州地區樣品為主，共計114份，占比53.3%(114/214)，其中分離出29株沙門菌，分離率為25.4%(29/114)；鎮江市分離率最高，達60.0%(6/10)，顯著高于揚州、滁州、泰州和南通地區(表1)(P<0.05)。鵝源樣品不同臟器組織中的沙門菌分離率無顯著差異(P>0.05)(表2)。

表1 鵝樣品來源和沙門菌分離率

表2 臨床病鵝不同組織沙門菌分離率

2.2 沙門菌血清型鑒定 50株沙門菌分屬8種血清型(表3)，分布比例為4%～60%，主要為B群血清型，因此鵝源沙門菌血清型分布較為廣泛。其中，鼠傷寒沙門菌占60%，是調查區域內的優勢血清型，其次腸炎沙門菌。

表3 沙門菌分離株血清型分布

2.3 藥敏試驗 藥敏試驗結果(表4)顯示，50株沙門菌對阿莫西林、鏈霉素和多西環素耐藥性較高，分別為44%(22/50)、38%(19/50)和38%(19/50)；其中，36株沙門菌對三類及三類以上抗菌藥耐藥，為多重耐藥(MDR)菌株(表4)。30株鼠傷寒沙門菌耐藥特點與50株沙門菌相似，對頭孢噻肟、阿莫西林和多西環素耐藥性較高，分別為40.0%(12/30)、36.7%(11/30)和36.7%(11/30)；但對氨基糖苷類藥物耐藥性較低，如阿米卡星、慶大霉素和卡那霉素耐藥率分別為0、3.3%(1/30)和6.7%(2/30)；20株鼠傷寒沙門菌為多重耐藥(表4)。

表4 沙門菌藥敏試驗

2.4 鵝源鼠傷寒沙門菌生物被膜形成檢測 結晶紫染色法定量檢測30株鼠傷寒沙門菌生物被膜形成能力，結果顯示，26株菌株能夠形成生物被膜，占86.7%(26/30),OD550值為(0.165±0.041)～(0.592±0.117)(表5)，其中18株鼠傷寒沙門菌成膜能力弱，8株成膜能力中等。

2.5 復方白頭翁散MIC和MBC的測定 MIC和MBC檢測結果顯示：復方白頭翁散提取液對30株鼠傷寒沙門菌均具有一定的抑殺效果(表5)。最小抑菌濃度(MIC)范圍23.44～375.00 mg/mL，最小殺菌濃度(MBC)范圍46.86～375.00 mg/mL。其中，40%菌株的MIC值為187.50 mg/mL，53.33%菌株的MBC值為375.00 mg/mL。

表5 鼠傷寒沙門菌的生物被膜形成及復方白頭翁散的MIC和MBC

2.6 復方白頭翁散抑制鼠傷寒沙門菌生物膜形成 復方白頭翁散抑制鼠傷寒沙門菌生物膜形成能力結果顯示，16倍稀釋的提取液(93.75 mg/mL)對鼠傷寒沙門菌生物膜形成能力抑制效果最好，達到89.84%。

3 討論

2017年5月—2018年7月從214份臨床樣品中分離出50株沙門菌，陽性率為23.4%。對10個市級區域送檢病料分離情況進行分析，鎮江地區送檢病料中沙門菌分離率最高，達60.0%(6/10)，顯著高于揚州、滁州、泰州和南通地區(表1)(P<0.05)。鵝源樣品不同臟器組織中的沙門菌分離率無顯著差異(P>0.05)(表2)。此次調查結果顯示，這一地區的鵝源沙門菌以鼠傷寒沙門菌為主要優勢血清型，與之前的報道一致[4]，但此次分離也有一些稀少的血清型出現，如里定沙門菌。這些特殊血清型沙門菌可能與場所環境、鳥類傳播相關，例如李玉軍等[13]在野鳥中分離出多種血清型的沙門菌。鵝生活環境與水鳥接觸的機會多，更易感染和傳播沙門菌[14-15]。

研究顯示鼠傷寒沙門菌形成生物被膜能力較強。付玉勤[4]測定33株鼠傷寒沙門菌中有28株(84.84%)菌株能夠形成生物被膜。孫化露等[16]對58株沙門菌生物被膜形成能力進行測定，結果顯示18株鼠傷寒沙門菌中有15株(83.33%)能夠形成生物被膜。在此次分離的30株鼠傷寒沙門菌中，有26株(86.7%)菌株能夠形成生物被膜，與上述研究結果相似。

鵝作為一種重要的水禽，在我國畜禽養殖業中占有重要比重，其養殖模式增加了與其他動物和野禽接觸的機會，為傳播細菌和耐藥菌株提供機會[14-15]。鼠傷寒沙門菌在鵝群中流行，容易形成生物被膜，可能會污染禽類相關食品，感染人類引起胃腸炎甚至類傷寒全身感染，是一種重要的人獸共患病病原。中藥具有抑菌、副作用小和不存在藥物殘留的優點，為減少耐藥菌株或多重耐藥菌株的形成，減少藥物殘留和抑制細菌生物被膜形成，保障公共衛生安全，可以使用中藥作為防控病菌感染的新途徑。體外抑菌試驗結果顯示，復方白頭翁散對鼠傷寒沙門菌有抑菌效果且可抑制生物被膜形成，MIC值可達23.44 mg/mL，MBC值可達46.87 mg/mL。其中，40%菌株的MIC值為187.50 mg/mL，53.33%菌株的MBC值為375.00 mg/mL，93.75 mg/mL濃度的復方白頭翁散抑制生物被膜形成效果最佳，平均抑制率達到89.84%。復方白頭翁散利用黃柏、黃芩和其他藥物組合多種成分，協同作用達到抑菌效果并抑制細菌生物被膜形成，有望成為一種新型的綠色的防控藥物。