豬肺源致病性多重耐藥大腸桿菌的分離鑒定和藥敏分析

朱春玲 ， 劉 麗 ， 劉少龍 ， 劉 欣 ， 王 恒 ， 趙雪芹 ， 趙婭婭 ， 劉雙雙 ， 夏小靜 ， 張守平 ， 羅維玉 ， 徐彥召 ， 杭柏林 ， 孫亞偉 ， 胡建和 ， 王 磊 , 張學明

(1.吉林大學動物醫學院 ， 吉林 長春 130000 ； 2.河南科技學院動物科技學院 ， 河南 新鄉 453003)

大腸桿菌(Escherichiacoli)是人和動物的腸道常見致病菌，近年來腸外致病性大腸桿菌的出現引起了學者們的關注，豬源性大腸桿菌也是我國養豬業的一大威脅，其血清型多且復雜，極易產生耐藥性，給該菌感染的防治帶來困難，并給我國養豬業造成較大經濟損失。河南新鄉地區某養殖場83例仔豬出現厭食、呼吸困難等癥狀，并伴隨不同程度的腹瀉，死亡率為4.5%，為確定該養殖場豬只呼吸系統感染的病原菌，本試驗于無菌條件下采集病死仔豬的肺臟，進行病原菌的分離和鑒定，證實病原菌為腸外致病性大腸桿菌，并發現其對臨床23種抗菌藥物均具有較強耐藥性，本試驗結果為腸外致病性大腸桿菌的鑒定和臨床用藥提供了有價值的數據支持。

1 材料與方法

1.1 樣品來源 本試驗肺臟采集于河南新鄉地區某規模化養殖場。

1.2 主要試劑 LB、伊紅美蘭和麥康凱培養基、革蘭染色試劑盒、DreamTaq Green Master Mix、DNA分子質量標準，均購自北京百泰克生物技術有限公司；細菌藥敏試紙盒，購自杭州濱河微生物試劑有限公司；細菌微量生化反應管，購自杭州微生物試劑有限公司。

1.3 主要儀器 超凈工作臺，購自上海志誠科技有限公司；37 ℃恒溫培養箱，購自上海一恒科學儀器有限公司；恒溫搖床，購自北方同正科級技術發展有限公司；PCR儀，購自英國TECHNE公司；JY-300C電泳儀凝膠、凝膠成像系統分析儀，均購自BIO-RAD(美國伯樂)公司。

1.4 方法

1.4.1 病原菌的分離純化和革蘭染色 無菌采取新鮮肺臟病料涂抹于無抗性LB瓊脂平板，37 ℃培養12～24 h。挑取單個可疑菌落接種于5 mL LB液體培養基中，37 ℃震蕩(200 r/min)培養12 h，重新接種于LB瓊脂平板，重復3～4次，獲得細菌純培養物，挑取可疑單個菌落進行革蘭染色。

1.4.2 病原菌培養特性觀察與生化試驗 將純化后的病原菌接種于LB 瓊脂、麥康凱瓊脂中，37 ℃培養12 h觀察菌落的形態特征及顏色變化。將細菌接種于細菌微量生化反應管中，37 ℃恒溫培養72 h，觀察試驗結果。

1.4.3 病原菌16S rRNA PCR 擴增及測序 采用PCR的方法獲得細菌16S rRNA，引物序列為：F：5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′；R：5′-TACGGYTA-CCTTGTTACGACTT-3′，擴增片段大小約為1 495 bp。擴增體系為20 μL：DreamTaq Green Master Mix 10 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，病原菌液1 μL，RNase-free H2O 7 μL。擴增程序：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性 30 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 20 s，35個循環；72 ℃再次延伸10 min。擴增完成后取10 μL擴增產物加入1%瓊脂糖凝膠進行電泳。將電泳產物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序，測序結果在NCBI網站BLAST中進行序列比對分析。

1.4.4 藥敏試驗 分離獲得的細菌培養至對數期，細菌濃度約為1×109CFU/mL，抽取1×108CFU均勻涂到LB 瓊脂平板上，用無菌鑷子夾取藥敏片并貼在布滿菌液的平板上，將平板倒置于37 ℃培養12～24 h，記錄結果。

2 結果

2.1 病原菌菌落形態觀察 將該分離菌株分別在LB和麥康凱培養基進行鑒別培養，結果顯示，該分離株在LB瓊脂平板上呈灰白色、圓形、扁平、光滑、濕潤、邊緣整齊的菌落(圖1A)；在麥康凱培養基上菌落呈粉紅色、圓形菌落(圖1B)。

圖1 分離菌株在不同培養基上的生長情況

2.2 生化試驗 采用微量發酵管對分離純化后的細菌進行生化反應測定，結果顯示，該分離菌能夠發酵葡萄糖、乳糖、甘露醇、蔗糖和麥芽糖，不能夠發酵阿拉伯糖、山梨醇、鄰-硝基酚-β-D-半乳糖苷(ONPG)、衛矛醇、七葉苷、水楊素、H2S和尿素，與標準大腸桿菌生化反應結果一致。

2.3 PCR擴增與序列比對 采用PCR方法擴增獲得分離菌株的16S rRNA片段，并進行凝膠電泳，發現該基因條帶大小約為1 500 bp，與預期大小相符合(圖2)。將擴增獲得的16S rRNA片段進行測序，在NCBI BLAST中進行序列比對，結果顯示，該分離菌株與大腸桿菌同源性為99%，判定該分離菌株為大腸桿菌。

圖2 分離菌株16S rRNA基因的PCR擴增

2.4 藥敏試驗 藥敏試驗結果(表1)顯示，分離菌株對阿米卡星、頭孢西叮、頭孢他啶和米諾環素敏感；對氨曲南中介；對卡那霉素、頭孢噻吩、氨芐西林、氯霉素、頭孢吡肟、頭孢噻肟、頭孢呋辛、頭孢曲松、環丙沙星、頭孢哌酮、青霉素G、哌拉西林、諾氟沙星、慶大霉素、鏈霉素、妥布霉素、頭孢唑林、氧氟沙星、呋喃妥因、四環素、萬古霉素、多黏菌素B和左氟沙星23種抗菌藥具有較強耐藥性；僅對阿米卡星、頭孢西叮、頭孢他啶和米諾環素具有藥物敏感性。

表1 藥敏試驗結果

3 討論

隨著抗生素的廣泛使用，導致目前豬源性大腸桿菌對極大部分抗生素產生了多重且高水平的耐藥性，并且催生了不同類型的耐藥基因[1-3]。朱力軍[4]對20世紀50—90年代初分離保存的大腸桿菌進行了藥敏試驗，證明了大腸桿菌對抗生素的耐藥性呈上升趨勢。交叉出現的耐藥基因、分離率逐漸增加的超級細菌、耐藥性呈上升趨勢的多重耐藥性菌株均導致豬源性大腸桿菌病愈發嚴重[4-6]。本試驗從河南某豬場分離出的致病性大腸桿菌對卡那霉素、頭孢噻吩、氨芐西林、氯霉素、頭孢吡肟、頭孢噻肟、頭孢呋辛、頭孢曲松等耐受，提示所分離的肺源大腸桿菌為多重耐藥性大腸桿菌，能夠導致肺臟的腫大、出血和壞死，從而導致豬只死亡。本試驗為多重耐藥大腸桿菌的鑒定和臨床用藥提供了參考依據。

目前，腸外致病性大腸桿菌致病研究成為熱點，腸外致病性大腸桿菌菌株包含多種基因組和廣泛的毒性因子(Virulence factors,VFs)，這些因子共同賦予了菌株在腸外部位定植和侵襲的能力，從而導致尿路感染、腦膜炎、肺炎、骨髓炎和手術部位感染[7]。肺致病性豬大腸桿菌感染屢次出現，Liu等[8]分離獲得豬腸外致病性大腸桿菌PCN033株，對其在體內的毒力進行分析，并在基因組方面與人類進行對比，發現PCN033株基因組與人類ExPEC株基因組序列同源性較高。Horn等[9]研究發現，禽致病性大腸桿菌能夠引起禽肺內產生局灶性感染，并伴有感染區域的炎癥反應和細胞死亡。Stormberg等[10]研究發現，從雞糞便中分離出的大腸桿菌含有與人腸外致病性大腸桿菌相關的基因，并可在動物模型中引起相應的感染。

腸外致病性大腸桿菌多重耐藥性的出現嚴重威脅著公共衛生安全，增加了人獸共患病的風險。有研究顯示，治療耐藥性菌株的成本約為敏感菌株的1.6倍[11]。國內外臨床、養殖環境中出現的大腸桿菌耐藥性比較嚴重，甚至南北極也出現耐藥的大腸桿菌[12]。本試驗中發現，大腸桿菌的耐藥性問題嚴重，在養殖中建議以加強飼養管理為重點，改進飼養環境，以求增強動物的抵抗力，減少患病概率，在必要的情況下給予適量敏感藥物治療，做到多種藥物聯合、分批使用，拒絕大量、盲目、多次使用同種藥物，本試驗為指導臨床用藥以及豬大腸桿菌的耐藥性研究提供參考。