牛乳鐵蛋白膠體金定量免疫檢測試劑卡的研制

井金苗 ， 王 靜 ， 魏治靜 ， 李亞璞 ， 柳峰松 ， 袁慶彬 ， 薛玉玲 ， 吳 萌

(1. 河北大學生命科學學院 ， 河北 保定 071002 ； 2. 河北省科學院生物研究所 ， 河北 石家莊 050081 ； 3.石家莊君樂寶乳業有限公司 ， 河北 石家莊 050221)

乳鐵蛋白(Lactoferrin，LF)是一種非血紅素鐵結合糖蛋白，主要存在于哺乳動物的乳汁中，分子量約80 kDa，含689個氨基酸，在改善腸胃功能、抗氧化、抗菌、抗癌、抗病毒等方面起重要作用，被廣泛應用于食品、化妝品、醫藥等領域[1-5]。此外，LF還具有增強機體免疫能力和調節機體生理狀態平衡的功能，是一種高效營養添加劑，在我國食品安全國家標準《食品營養強化劑使用標準》GB14880—2012中將其列為營養強化劑。目前，牛乳仍是乳制品的主要奶源，因而牛乳鐵蛋白(Bovine lactoferrin，BLF)作為一種主要的營養強化劑，在乳制品檢測方面對于產品質量保障具有重要意義。

LF的檢測方法主要有聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)[6]、毛細管電泳法[7]、分光光度法[8]、酶聯免疫吸附檢測(ELISA)[9]、高效液相色譜(HPLC)[10]、高效液相色譜串聯質譜(HPLC-MS/MS)[11-12]、膠體金免疫層析法[13-14]等。從時間、費用、樣品處理、準確性等方面對比各個檢測方法發現，SDS-PAGE不宜大批量檢測；毛細管電泳法與分光光度法對樣品要求高，需對樣品進行預處理；ELISA干擾因素多；國外檢測乳鐵蛋白多采用HPLC和HPLC-MS/MS方法[15-16]，這2種方法操作簡單，耗時短，耗樣量少，準確性高，但設備昂貴且需專業人員操作；膠體金免疫層析法操作簡單，成本低廉，靈敏度高，檢測快速且準確。本試驗利用自主研制的優質BLF單克隆抗體構建膠體金免疫層析定量檢測試劑卡，用于檢測樣品中的BLF，為乳制品中BLF的檢測提供一種快捷、準確的定量方法。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 牛乳鐵蛋白(純度>95%)，購自日本WAKO公司；青鏈霉素混合液，購自Solarbio公司；弗式完全佐劑(FCA)、弗式不完全佐劑(FIA)、HAT添加劑(HAT supplement)、HT添加劑(HT supplement)、氯金酸、聚乙二醇(PEG)，均購自Sigma公司；胎牛血清，購自BI公司；牛血清白蛋白，購自Roche公司；DMEM細胞培養基(粉末型)，購自Gibco公司；HEPES，購自Amersco公司；HRP標記山羊抗小鼠IgG，購自北京中杉金橋生物技術有限公司；CN95硝酸纖維素(NC)膜，購自Sartorius公司；玻璃纖維素膜，購自上海杰一生物技術有限公司；聚氯乙烯(PVC)底板、吸水紙，均購自上海金標生物科技有限公司；Tween-20、碳酸鈉、濃硫酸、檸檬酸三鈉、碳酸鉀、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉等，均為國產分析純；牛奶樣本采自河北省行唐縣畜產品質量檢測站；SP2/0骨髓瘤細胞由河北省科學院生物研究所保存。

1.2 主要儀器 超凈工作臺，蘇州凈化設備有限公司產品；CO2培養箱，SANYO公司產品；恒溫水浴箱，上海一恒科技有限公司產品；倒置顯微鏡，Olympus公司產品；細胞培養板和細胞培養瓶，均為Eppendorf公司產品；三維平面劃膜噴金儀和微電腦自動斬切機，均為上海金標公司產品；高效液相色譜儀，美國Agilent公司產品；膠體金讀數儀，河北森越生物科技有限公司產品。

1.3 實驗動物 BLAB/c小鼠，雌性，6～8周齡，購自河北省實驗動物中心。

1.4 BLF單克隆抗體的制備

1.4.1 免疫小鼠 選3只6～8周齡的BLAB/c小鼠作為實驗動物，抗原為牛乳鐵蛋白。用無菌生理鹽水溶解抗原后與等體積的弗式佐劑混合并充分震蕩乳化，對小鼠進行皮下多點注射，每只小鼠注射抗原50 μg，共免疫3～4次，每次間隔2周。第1次免疫用弗式完全佐劑，第2～4次免疫用弗式不完全佐劑，在第3次免疫1周后取眼球血檢測效價，選擇效價最高的小鼠進行細胞融合，并在細胞融合前3天腹腔注射50 μg抗原加強免疫。

1.4.2 細胞融合 采用PEG法進行細胞融合，在細胞融合前1周復蘇SP2/0骨髓瘤細胞，使細胞處于對數生長期。頸椎脫臼法處死小鼠，在無菌條件下取脾臟，用DMEM培養液吹出脾細胞，將脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞以10∶1的比例混合，1 min內逐滴加入800 μL PEG融合劑，使PEG與細胞充分接觸完成融合，之后用HAT選擇培養基培養細胞。

1.4.3 篩選陽性雜交瘤細胞 采用間接ELISA檢測篩選陽性雜交瘤細胞，以免疫小鼠眼球血清為陽性對照，正常小鼠眼球血清為陰性對照，不含小鼠血清的洗滌液(含有0.05% Tween-20的磷酸鹽緩沖液，PBST)為空白對照，篩選出檢測結果為陽性的雜交瘤細胞團，用有限稀釋法進行亞克隆，篩選出單一的能穩定分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞。

1.4.4 獲取單克隆抗體 擴大培養篩選出的陽性雜交瘤細胞，采用小鼠體內誘生法獲得腹水，用辛酸硫酸銨沉淀法純化腹水獲得2株單克隆抗體2B11和2E2。

1.5 BLF單克隆抗體的鑒定 采用常規SDS-PAGE鑒定抗體純化效果并用間接ELISA檢測1 μg單克隆抗體的效價。

1.6 膠體金定量檢測試劑卡的制備

1.6.1 膠體金的制備 將100 mL超純水置于磁力加熱攪拌器上攪拌煮沸，加入1 mL 1%氯金酸溶液，待溶液煮沸后再加入1 mL 1%檸檬酸三鈉，繼續加熱攪拌15 min后停止加熱，冷卻至室溫后定容至100 mL。

1.6.2 最適標記pH的確定 取1 mL燒制好的膠體金溶液分別加入至4個1.5 mL離心管中，然后分別加入0.1 mol/L K2CO3溶液調節pH至4.0、5.5、7.0和8.5，混勻后向其中分別加入5 μg乳鐵蛋白抗體2B11反應30 min，再逐滴加入10%牛血清蛋白(BSA)溶液50 μL，30 min后離心棄上清，復溶液重懸，冷藏避光保存。

1.6.3 最適標記抗體投料量的確定 取1 mL膠體金溶液分別加入至4個1.5 mL離心管中，加入0.1 mol/L K2CO3溶液調節pH至5.5，充分混勻之后，分別加入1、3、5 μg和10 μg乳鐵蛋白抗體反應30 min。然后向上述溶液中逐滴加入10% BSA溶液50 μL，30 min后離心棄上清，復溶液重懸，冷藏避光保存。

1.6.4 抗體包被 將牛乳鐵蛋白2E2抗體作為檢測線(T線)，以1 mg/mL濃度包被到NC膜上，質控線(C線)用兔抗鼠IgG，包被濃度為1 mg/mL。

1.6.5 膠體金定量檢測試劑卡的組裝 首先將NC膜粘貼在PVC底板上，在NC膜的C線和T線上分別包被對應抗體，于60 ℃干燥4 h；將膠體金標記BLF單克隆抗體2B11按4 μL/cm噴涂于玻璃纖維素膜上，37 ℃過夜干燥，作為結合墊；在NC膜靠近C線一端粘接吸水紙，在靠近T線一端依次粘接結合墊、樣品墊，并切成3 mm寬的膠體金定量檢測試劑卡，裝入卡殼，干燥密封備用。

1.6.6 檢測條件的確定 準備檢測試紙，分別在50、70、90 μL和110 μL加樣量條件下，向加樣孔中加入400 ng/mL抗原反應，并根據試驗結果確定合適加樣量；分別在反應5、10 min和15 min時檢測，以確定最佳反應時間。

1.6.7 標準曲線的制作 將BLF用高效液相色譜法進行測定標化，配制50、125、250、500 μg/mL和1 000 μg/mL的標準品溶液，將標準品溶液分別稀釋5 000倍用膠體金定量檢測試劑卡進行檢測，得到灰度值并繪制產品標準曲線。

1.7 膠體金定量檢測試劑卡的性能測試

1.7.1 空白限 取不含BLF的樣本稀釋液作為0 μg/mL樣本，使用試劑卡重復測試該樣本20次，計算檢測信號的平均值(AV)及標準差(SD)，并計算出AV+2SD的數值，將該數值帶入定標曲線得到空白限。

1.7.2 重復性 分別取濃度為50、125 μg/mL和1 000 μg/mL的3支標準品進行檢測，每個濃度重復檢測10次，并根據檢測結果計算CV值。

1.7.3 線性 分別取50、125、250、500 μg/mL和1 000 μg/mL樣本進行檢測，每個濃度平行檢測3次，取測得濃度的平均值與理論濃度值進行直線擬合并計算其線性回歸相關系數R。

1.7.4 牛奶樣本檢測 取10份牛奶樣本，分別用膠體金免疫層析檢測法和高效液相色譜法進行檢測，以高效液相色譜法的檢測結果為橫坐標，以膠體金免疫層析檢測法的檢測結果為縱坐標，進行直線擬合，計算得到線性相關系數R。

1.7.5 特異性 將α-乳白蛋白和β-乳球蛋白分別用樣本稀釋液配制成1 000 ng/mL溶液，使用研制的膠體金定量檢測試劑卡分別對2種蛋白重復檢測3次，評估其交叉反應。

2 結果

2.1 BLF免疫小鼠效價檢測 用免疫原BLF免疫BLAB/c小鼠后采用間接ELISA檢測抗體效價，3只小鼠的效價均達到2.48×105以上，挑選效價最高的小鼠進行后續試驗。

2.2 BLF單克隆抗體的鑒定

2.2.1 純度鑒定 經SDS-PAGE電泳檢測(圖1)，BLF單抗(IgG)均在相對分子質量50 kDa和25 kDa附近出現明顯的條帶，分別對應抗體的重鏈和輕鏈，純度良好。

圖1 純化BLF單克隆抗體的SDS-PAGE鑒定

2.2.2 效價鑒定 取BLF單抗2B11和2E2各1 μg，通過間接ELISA檢測效價，且采用每個稀釋倍數重復檢測1次的方法，檢測結果計算AV及SD，如圖2所示，1 μg的BLF單抗2B11和2E2效價分別達到6.5×106和3.2×106。

圖2 BLF單克隆抗體的效價分析

2.3 膠體金定量檢測試劑卡的研制

2.3.1 最適標記pH的確定 將制備的金標抗體分別點涂至未噴金的膠體金定量檢測試劑卡結合墊上，各組均檢測0、10、100 ng/mL和1 000 ng/mL抗原，每個濃度檢測3次，計算檢測結果的AV及SD。

在pH為4.0時，檢測0 ng/mL樣本的灰度值大于0，出現假陽性；在pH為5.5、7.0和8.5時，檢測0 ng/mL樣本的灰度值均為0，在這3個pH條件下，pH為5.5時檢測靈敏度高，線性梯度好，所以根據檢測結果確定最適標記pH為5.5(圖3)。

圖3 BLF膠體金定量檢測試劑卡最適pH的篩選

2.3.2 最適蛋白標記量的確定 將制備的金標抗體分別點涂至未噴金的膠體金定量檢測試劑卡結合墊上，各組均檢測0、10、100 ng/mL和1 000 ng/mL抗原，每個濃度檢測3次，計算檢測結果的AV和SD。檢測結果見圖4，在抗體標記量為1 μg/mL時，檢測數值偏低，靈敏度低；在抗體標記量為3 μg/mL時，線性及靈敏度偏低；在抗體標記量為5 μg/mL和10 μg/mL時，線性及靈敏度都很高，檢測數值無明顯差異，為避免原料的浪費，確定抗體的標記量為5 μg/mL。

圖4 BLF膠體金定量檢測試劑卡蛋白標記量的篩選

2.3.3 檢測條件的確定 由圖5 A可知，上樣量90 μL和110 μL結合墊有殘留，故加樣量50～70 μL最合適；反應時間5 min(圖5B)和10 min(圖5C)時NC膜上有紅色顏色殘留，反應時間15 min(圖5D)背景最干凈，無紅色顏色殘留。因此，試驗操作加樣量選擇60 μL，反應時間為15 min。

圖5 BLF膠體金定量檢測試劑卡加樣量及檢測時間的篩選

圖6 BLF膠體金定量檢測試劑卡標準曲線

2.4 性能測試

2.4.1 空白限 計算重復檢測20次0 μg/mL樣本的信號值AV+2SD結果為29.88。將該結果代入標準曲線方程，可計算得到空白限為21.86 μg/mL。

2.4.2 重復性 根據檢測結果(表1)計算3支不同濃度的標準品的CV值，結果均小于13%，表明BLF膠體金定量檢測試劑卡重復性良好。

表1 BLF膠體金定量檢測試劑卡的重復性

2.4.3 線性 通過對樣本進行各點重復3次檢測，計算得到y=1.179 8x-25.661，其線性相關系數為R=0.997 7，表明BLF膠體金定量檢測試劑卡具有良好的線性。

2.4.4 牛奶樣本檢測 對比膠體金法和用高效液相色譜法的牛奶樣本檢測結果，計算得相關系數R=0.988 5(圖7)，表明二者檢測結果的相關性較好。

圖7 BLF膠體金免疫層析法與液相色譜法檢測樣本的相關性

2.4.5 特異性 將α-乳白蛋白和β-乳球蛋白作為樣品分別滴加到膠體金定量檢測試劑卡中，檢測值均為0(表2)，即BLF膠體金定量檢測試劑卡與二者不存在交叉反應，而僅針對BLF具有良好的特異性反應。

表2 BLF膠體金定量檢測試劑卡的特異性

3 討論

在我國，膠體金免疫層析技術最開始是測定人絨毛膜促性腺激素(HCG)，之后在早孕、毒品、疾病[17-18]、食品的檢測方面得到廣泛的應用。目前在食品檢測方面，其可以對三聚氰胺[19-20]、致病菌污染[21]、抗生素[22-23]、農藥殘留[24]、重金屬[25-26]、致癌物[27]等快速檢測。本試驗以牛乳鐵蛋白(BLF)為免疫原制備了2株抗BLF的雜交瘤細胞株2B11和2E2，采用小鼠體內誘生法制備單克隆抗體，單抗經辛酸硫酸銨沉淀法純化，經檢測2個單抗純度好且效價高。基于BLF單抗建立快速檢測BLF的膠體金定量檢測試劑卡檢測方法，經過優化，膠體金定量檢測試劑卡的重復性和線性良好且特異性強，可用于乳及乳制品中BLF的快速檢測。

目前市場中的乳制品檢測多為高效液相色譜法，其準確性高，但需要昂貴的儀器設備和專業人員，而以免疫層析法為基礎研制的膠體金檢測試劑卡操作簡單，價格低廉，與高效液相色譜法的樣本檢測結果的相關系數達到0.988 5，為檢測樣品中的BLF提供了一種快速、靈敏、簡便的定量檢測方法。但本方法目前檢測的樣本量有限，其準確度等性能有待進一步評估。

隨著生活物質資源的日趨豐富，市場上的動物乳制品已不僅局限于牛奶，據報道羊奶及牦牛奶各有優點[12]。針對不同動物來源乳制品中的乳鐵蛋白含量檢測產品的開發，將是未來需要補充的空白[28]。本課題組接下來可以在現有的技術平臺基礎上，很快研發出針對不同來源乳制品中乳鐵蛋白含量的一系列快速檢測產品。