禽腺病毒4型熒光定量PCR檢測方法的建立與初步評估

王國康 ， 盧 琴 ， 賈妙妙 ， 李 麗 ， 馮賀龍 ， 邵華斌 ， 羅青平 ， 曾 馳 ， 溫國元

(1. 武漢輕工大學生物與制藥工程學院 ， 湖北 武漢 430023 ； 2. 湖北省農業科學院畜牧獸醫研究所 ， 湖北 武漢 430064 ； 3. 農業農村部畜禽細菌病防治制劑創制重點實驗室 ， 湖北 武漢 430064 ； 4. 畜禽病原微生物學湖北省重點實驗室 ， 湖北 武漢 430064)

禽腺病毒(Fowl adenovirus,FAdV)是家禽和野禽的常見傳染病病原，一般呈感染率高、發病率低等特點，以隱性感染的形式普遍存在于雞群中。在家禽免疫力低下、存在免疫抑制病或多病原混合感染時會導致感染的禽群發病。FAdV為腺病毒科禽腺病毒屬成員，其基因組為單股雙鏈DNA[1]。FAdV分為I、II和III共3個群，其中I群又分為A、B、C、D和E共5個亞群，包含12個血清型[2-3]。FAdV的主要結構蛋白有五鄰體(Penton)、六鄰體(Hexon)、纖突(Fiber)蛋白以及衣殼蛋白pⅠ、pVⅡ、PIIIa等，以這些蛋白為主構成了病毒粒子的核衣殼[4-5]。

2015年以來，雞心包積水-肝炎綜合征(Hydropericardium hepatitissyndrome,HHS)疫情在我國大面積流行，對養雞業造成了嚴重的經濟損失。FAdV血清4型(Fowl adenovirus serotype-4,FAdV-4)是HHS的病原，被歸為I群C亞群，為我國當前主要流行的血清型[6]。與其他血清型相比，FAdV-4對雞的致病性較強。發病雞通常出現食欲不振、貧血、羽毛雜亂、雞冠顏色變淺等癥狀，隨后在3～5周齡突然死亡，并伴有淡黃色心包積液，偶有在肝臟形成包涵體，死亡率30%～90%[7]。由于FAdV-8和FAdV-11等其他血清型也在禽群中存在一定程度的感染。因此，為便于開展HHS的流行病學及臨床檢測等工作，有必要建立一種針對FAdV-4的病原學檢測方法。

目前，針對FAdV-4的檢測方法主要有瓊脂擴散試驗、酶聯免疫吸附法、病毒分離鑒定和常規 PCR方法等[8]。熒光PCR方法是在常規PCR的基礎上引入了熒光探針，其檢測特異性和敏感性得到了增強，在特異檢測FAdV-4病原方面具有一定的優勢[9]。本研究以FAdV-4的Hexon基因為擴增靶區，設計了PCR引物和TaqMan探針，通過檢測條件的優化，建立了FAdV-4熒光定量PCR檢測方法，以期為該病的病原學監測和疫情診斷提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 病毒和樣品 FAdV-4 HB1510株、雞減蛋綜合征病毒HB76株、新城疫病毒LaSota株、雞傳染性支氣管炎病毒H120株、H9N2禽流感病毒JM0305株和雞大腸桿菌SS17-38株，均由本實驗室保存。65份組織樣品采集自湖北省武漢市新洲區和漢川市的養雞場。

1.2 試劑和主要儀器 DNA提取試劑盒，購自美國 Axygen公司；熒光定量專用預混液(探針法)AceQ qPCR Probe Master Mix、快速PCR 2×Rapid Taq Master Mix，均購自南京諾唯贊生物科技有限公司；Trans2K Plus DNA Marker，購自北京全式金生物技術有限公司；DL2 000 DNA Marker，購自寶生物工程(大連)有限公司。熒光定量PCR儀為Bio-Rad公司生產的iQ5 Real Time PCR System。

1.3 引物和探針序列的設計合成 對NCBI上GenBank中的FAdV-4Hexon基因序列進行比對，選取其中相對保守的區域。根據保守區域序列，應用Primer Express 3.0軟件設計了2對引物和1條探針(表1)，分別用于熒光定量PCR和常規PCR檢測。探針的5′端以熒光報告基團FAM標記，3′端以熒光淬滅基團TAMRA標記。引物和探針由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 FAdV-4 熒光定量PCR和常規PCR方法的引物和探針序列

1.4 病毒核酸提取及標準品制備 病毒基因組提取采用小量DNA提取試劑盒，細菌基因組的提取采用細菌基因組提取試劑盒。提取的病毒和細菌基因組在-80 ℃保存待用。將FAdV-4細胞毒(105.0EID50/mL)進行10倍連續梯度稀釋，直至10 EID50/mL， 稀釋后的樣品即可作為檢測標準品。

1.5 熒光定量PCR檢測方法 熒光定量PCR反應體系：AceQ qPCR Probe Master Mix 10 μL，PCR引物對(FAdV-F和FAdV-R)各1 μL，熒光探針(FADV-P)1 μL，DNA模板1 μL，加水補至20 μL。熒光定量PCR反應條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性10 s，55 ℃退火和延伸35 s，50個循環。在此基礎上，分別對引物及探針濃度、退火溫度及循環次數進行優化。

1.6 常規PCR檢測方法 常規PCR反應體系：2× Rapid Taq Master Mix 12.5 μL，PCR引物對(hexon-F和hexon-R)各1 μL，DNA模板1 μL，加水補至20 μL。 常規PCR反應條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性15 s，56 ℃退火10 s，72 ℃延伸15 s，35個循環；72 ℃延伸5 min。2%瓊脂糖凝膠電泳檢測目的條帶。

1.7 臨床樣品的檢測 臨床采集的組織樣品按照1∶10(組織體重∶PBS體積)的比例加入PBS(pH 7.4)，充分勻漿處理，高速離心去除沉淀。收集上清進行病毒基因組DNA的提取，用建立的熒光定量PCR和常規PCR方法進行檢測，分析結果，比較兩者的檢測符合率。

2 結果

2.1 擴增靶區的選擇 對NCBI上GenBank數據庫中的各種血清型FAdV的Hexon序列進行比對分析，確定了一段在FAdV-4內高度保守、與其他血清型FAdV存在較大差異的序列。以該序列為擴增靶區，設計合成了PCR引物和TaqMan熒光探針。如圖1所示，引物和探針序列與FAdV-4的毒株序列高度匹配，與我國流行的其他2種血清型FAdV-8和FAdV-11匹配性較差，FAdV-8不匹配堿基與總堿基之比分別為FAdV-F：10/16，FAdV-R：14/21，FAdV-P：9/22；FAdV-11不匹配堿基與總堿基之比分別為FAdV-F：9/16，FAdV-R：12/21，FAdV-P：10/22。序列分析結果表明，設計的引物和探針序列具有較好的FAdV-4特異性。

圖1 熒光定量PCR的引物和探針與不同血清型FAdV毒株的序列匹配結果

2.2 熒光定量PCR檢測條件的優化 經過各種檢測條件的優化試驗，確定了熒光定量PCR檢測的反應體系及反應條件。反應體系：AceQ qPCR Probe Master Mix 10 μL，上下游引物終濃度為0.1 μmol/L，探針的終濃度為0.4 μmol/L，DNA模板為1 μL，最終加水補至20 μL；反應條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火35 s，40個循環，在每個循環60 ℃退火階段收集熒光信號。

2.3 熒光定量PCR檢測方法的敏感性試驗 采用優化的FAdV-4熒光定量PCR檢測條件，對梯度稀釋的FAdV-4標準品(104、103、102EID50/mL和10 EID50/mL)進行病毒基因組DNA提取及熒光PCR反應，得到熒光定量PCR擴增動力學曲線(圖2)和標準曲線(圖3)。結果表明，熒光定量PCR可檢測到病毒的最低濃度為10 EID50/mL。 在104～101EID50/mL 的濃度范圍內，病毒滴度與Ct值呈良好的線性關系，標準曲線的線性回歸方程為y=-3.286x+47.786，相關系數為0.994，擴增效率為101.5%。以常規PCR方法對上述標準品進行檢測，能夠檢測出的最低病毒滴度為102EID50/mL(圖4)。熒光定量PCR方法的檢測敏感性比常規PCR高10倍。

圖2 FAdV-4熒光定量PCR檢測方法的標準曲線

圖3 FAdV-4熒光定量PCR檢測方法的擴增動力學曲線

圖4 FAdV-4常規PCR檢測方法的敏感性檢測結果

2.4 熒光定量PCR檢測方法的特異性試驗 建立的FAdV-4熒光定量PCR檢測方法，對FAdV-4 HB1510株、雞減蛋綜合征病毒HB76株、新城疫病毒LaSota株、雞傳染性支氣管炎病毒H120株、H9N2禽流感病毒JM0305株和雞大腸桿菌SS17-38株進行檢測。結果顯示，僅有FAdV-4檢測為陽性，其余樣品與空白對照檢測均為陰性，表明該檢測方法具有較好的特異性。

2.5 熒光PCR檢測方法的重復性試驗 建立的FAdV-4熒光PCR檢測方法，對4份FAdV-4臨床陽性組織樣品進行重復性檢測，以分析其組內與組間重復性。結果表明，組內重復性試驗中，Ct值的變異系數CV在0.31%～0.55%；組間重復性試驗中，Ct值的變異系數CV在0.44%～1.12%(表2)。組內和組間變異系數均較小，表明建立的FAdV-4熒光定量PCR檢測方法具有良好的重復性。

表2 FAdV-4熒光定量 PCR的重復性檢測結果

2.6 熒光定量PCR檢測方法的臨床應用 5份臨床采集的組織樣品同時進行FAdV-4熒光定量PCR和常規PCR檢測。結果如表3所示，熒光定量PCR檢測的陽性數為9份，常規PCR檢測的陽性數為3份。與常規PCR方法相比，熒光定量PCR方法的檢測符合率為90.7%(59/65=90.7%)，檢測敏感性為100%(3/3=100%)，檢測特異性為90.3%(56/62=90.3%)。

表3 FAdV-4熒光定量PCR和常規PCR的臨床樣品檢測比較

3 討論

1987年3月由FAdV-4引起的HHS在巴基斯坦的安卡拉地區首次暴發，隨后世界各地相繼出現HHS疫情[10]。我國HHS疫情在2010年以后呈現了上升趨勢，以2015年為分界線。2015年以前，僅有零星HHS疫情發生，但2015年之后，我國許多省市相繼暴發HHS疫情，且疫情范圍仍在不斷擴大，給我國養雞業帶來了嚴重的經濟損失[11]。為監測FAdV-4病原流行情況和疫情診斷，急需一種特異、敏感的FAdV-4病原檢測方法。

當前FAdV-4的檢測方法主要有瓊脂擴散、酶聯免疫吸附和常規PCR等方法。由于FAdV-8和FAdV-11等其他血清型毒株的臨床感染情況較為普遍，這對FAdV-4的特異性檢測造成了一定程度的干擾[12]。熒光定量PCR技術以其高靈敏度、高特異性、檢測速度快等優點，在病原的定性和定量檢測方面得到了廣泛應用[9]。該技術可分為染料法和探針法。染料法中的熒光染料主要與雙鏈DNA分子結合，所以當出現引物二聚體、單鏈二級結構和非特異性擴增產物時，也會產生熒光信號，導致出現假陽性[13-14]。Hexon基因保守區段GC含量較高，擴增時易產生引物二聚體，從而影響檢測結果[15]。TaqMan探針法通過要合成標記有熒光染料的探針，即使有1個堿基突變也會影響探針的結合及檢測效果，具有較高的檢測特異性[13-16]。Hexon蛋白是FAdV病毒核衣殼的重要組成部分，具有群、亞群及型特異性的抗原決定簇[17-18]，是實現FAdV-4特異檢測的優選基因。

本研究通過對Hexon基因序列比對分析，設計合成了PCR引物和TaqMan熒光探針，其序列與FAdV-4的毒株高度匹配，而與其他血清型FAdV匹配性較差。經過引物、探針的濃度、退火溫度和循環數等一系列檢測條件優化之后，建立了快速檢測FAdV-4的熒光定量PCR檢測方法。敏感性試驗中，TaqMan探針熒光定量PCR檢測方法比常規PCR檢測方法高10倍。特異性試驗中，用各種病毒的核酸進行熒光定量PCR檢測，除了FAdV-4外，其他病原均未出現有效擴增，表明特異性良好。重復性試驗中，組內重復和組間重復變異系數均較小，說明重復性較好。臨床樣品檢測中，與常規PCR方法相比,熒光定量PCR方法的檢測符合率為90.8%，診斷靈敏度為100%，診斷特異性為90.3%。綜上，FAdV-4熒光定量PCR檢測方法敏感性高、特異性強、重復性好、操作簡單快速，可為我國FAdV-4的流行病學監測和疫情診斷提供有力的技術支撐。