四川省甘孜州藏豬戊型肝炎病毒分子流行病學調查

楊丹嬌 ， 張 敏 ， 何宗偉 ， 楊 珊 ， 陳亭宇 ， 王艷瓊 ， 葉忠明 ， 湯 承

(1.甘孜藏族自治州畜牧業科學研究所 ， 四川 康定 626000 ； 2.四川省稻城縣農牧農村和科技局 ， 四川 稻城 627750 ； 3.四川省鄉城縣農牧農村和科技局 ， 四川 鄉城 627850 ; 4.西南民族大學畜牧獸醫學院 ， 四川 成都 610041)

戊型肝炎(Hepatitis E，HE)是由戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus，HEV)引起的一種人獸共患傳染病[1]。世界衛生組織(WHO)估計，全球每年有HEV感染者約2 000萬例，300多萬人有癥狀，5.6萬人死于戊型肝炎病毒感染，該病已成為重要的公共衛生問題[2]。HEV不僅可以感染人類，還可以在動物中廣泛分布與傳播，豬源HEV可能是引起人感染戊型肝炎病毒的重要源頭[3]。因此對HE流行及傳播進行監測具有重要現實意義。ORF2為HEV的主要結構基因編碼區，其核苷酸序列也最為保守，ORF2蛋白是HEV復制、傳染性和免疫反應性的關鍵蛋白，存在多個抗原表位，是誘導機體產生中和抗體的重要抗原表位，是目前疫苗和診斷試劑研發的主要研究抗原片段[4]。藏豬是眾多畜禽品種資源中極具特色的品種之一，主要分布在四川甘孜、阿壩、青海、西藏等海拔3 000 m以上的高山或河谷地區[5]，在四川省甘孜州主要分布在稻城、鄉城、康定、瀘定等地。藏豬主要與高原上的其他動物(如牦牛、藏羊等)混養，與當地牧民共用水源等，這種密切接觸的養殖模式加劇了人和其他動物之間疾病的跨種傳播[6-7]，加劇了HEV的傳播和流行。為調查四川省甘孜藏族自治州藏豬戊型肝炎病毒的流行情況，本試驗采集了該地區4個縣10個藏豬養殖場的229份糞便樣本進行分子流行病學調查，并分析其遺傳進化特征。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 TRIzol總RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒、連接試劑盒，均購自TaKaRa公司；pMD19-T載體、DNA MarkerⅡ、大腸桿菌DH5α感受態細胞，均購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.2 主要儀器 恒壓恒流電泳儀、瓊脂糖水平電泳槽、超凈工作臺，均購自北京六一儀器廠；凝膠成像儀、PCR儀，均購自Bio-Rad公司；冷凍離心機，購自四川蜀科儀器有限公司。

1.3 臨床樣本 于2018—2019年采集四川省稻城、鄉城、瀘定、瀘定4個縣10個藏豬養殖場的糞便樣本229份，其中腹瀉糞便樣本145份，臨床健康藏豬糞便樣本84份。所有采樣的藏豬養殖場均未進行HEV疫苗免疫，所有樣品均低溫運輸，于-80 ℃保存備用。

1.4 試驗方法

1.4.1 RNA的提取及cDNA的合成 用TRIzol法抽提樣本中總RNA。按照反轉錄試劑盒說明書制備cDNA。反應體系：總RNA 4 μL，5×Buffer 2 μL，oligo(dT)0.5 μL，反轉錄酶0.5 μL，RNase-Free Water 3 μL。反轉錄程序：37 ℃ 15 min，85 ℃ 15 s，16 ℃保存。將cDNA放置-20 ℃保存備用。

1.4.2 引物的設計與合成 采用參考文獻[8]中報道的檢測引物及方法對HEV進行分子檢測，目的條帶為644 bp。按參考文獻[9]報道的HEVORF2基因擴增的引物序列(表1)對陽性樣本的cDNA進行ORF2基因部分片段擴增，引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 ORF 2基因引物信息

1.4.3 反轉錄套式聚合酶鏈反應(RT-nPCR)方法進行HEV的分子檢測 以1.4.2中合成的HEV檢測引物對樣本的cDNA進行PCR檢測。PCR擴增體系：Quick Taq HS DyeMix 12.5 μL，上下游引物各1 μL，cDNA模板1 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR擴增程序：94 ℃預變性2 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個循環；72 ℃延伸8 min。通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產物。

1.4.4 HEVORF2基因部分序列的擴增 取陽性樣本的cDNA進行2輪PCR，第1輪PCR擴增體系：Quick Taq HS DyeMix 12.5 μL，上下游引物各1 μL，cDNA模板2 μL，ddH2O 8.5 μL。PCR擴增程序：94 ℃預變性 2 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個循環；72 ℃再延伸10 min。第1輪PCR擴增產物作為第2輪PCR擴增模板。第2輪PCR擴增體系：Quick Taq HS DyeMix 12.5 μL，上下游引物各1 μL，DNA模板2 μL，ddH2O 8.5 μL。PCR擴增程序：94 ℃預變性2 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個循環；72 ℃再延伸10 min。根據凝膠回收試劑盒說明書進行回收純化，按照pMD19-T Vector Cloning Kit說明書進行連接，并轉化至DH5α感受態細胞中，篩選陽性克隆送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.4.5 HEVORF2基因序列的遺傳進化分析 測序成功的基因序列，參照GenBank中公布的HEV分離毒株ORF2基因序列，使用Seqman軟件進行拼接，并運用MegAlign軟件將獲得的ORF2基因序列與參考毒株序列進行核苷酸序列和推導的氨基酸序列比對分析，并利用MEGA 7.0軟件的鄰近法(Neighbor-joining)構建系統進化樹。

2 結果

2.1 藏豬源HEV的分子檢測 結果如表2所示，在糞便樣本中，HEV核酸陽性率為16.59%(38/229，95%CI=12.00%～22.10%)；10個規模藏豬場中，HEV場陽性率為70%(7/10，95%CI=34.8%～93.3%)，腹瀉糞便樣本陽性率為24.14%(35/145，95%CI=17.4%～31.9%)，臨床健康豬糞便樣本陽性率為3.57%(3/84，95%CI=0.7%～10.1%)。部分樣品的PCR擴增結果見圖1。

表2 229份藏豬糞便樣本HEV RT-nPCR檢測結果

圖1 HEV RT-nPCR擴增部分結果

2.2 HEVORF2基因擴增 利用2對ORF2基因的擴增引物，對38份陽性樣本進行HEVORF2基因片段的擴增，PCR擴增產物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定，出現與預期長度相符的目的條帶(圖2)。

圖2 ORF2基因的PCR擴增

2.3 HEVORF2基因核苷酸序列 對38個陽性樣本進行ORF2基因的克隆測序，所得的38株ORF2基因部分序列均提交至GenBank數據庫，其核苷酸序列在GenBank登錄號為MK410054～MK410091。序列分析結果顯示，38個序列彼此之間的核苷酸序列相似性為76.1%～100.0%，推導的氨基酸序列相似性為79.6%～100.0%，與參考毒株基因1～4型核苷酸序列相似性為75.2%～97.6%，與基因4型毒株的相似性最高，核苷酸序列相似性為75.8%～97.6%。

2.4 HEVORF2基因遺傳進化分析 利用來自藏豬的38個HEVORF2基因的577 bp序列片段與來自GenBank數據庫的其他38個HEV分離株的ORF2序列構建系統發育樹，結果如圖3所示，本試驗獲得的所有38個HEV序列獨立為一大支，均屬于G4型，與人源的HEV毒株親緣關系最近。進一步將38株HEV菌株分為4個亞型：亞型4a(31株)、亞型4j(4株)、亞型4d(2株)和亞型4b(1株)。本試驗中亞型4a明顯占優勢，可能在藏豬中循環。

圖3 HEV ORF2部分基因序列進化樹

3 討論

在青藏高原中，藏豬、牦牛、藏羊等不同的動物在牧場中與當地牧民密切接觸，共用水源與食物等[10]，在這種多樣化的生態系統和自由選擇的育種系統中，動物有更多的機會被HEV感染[11]，使HEV的傳播和流行加劇。研究者對西藏的藏豬進行HEV流行病學調查，結果顯示血清 HEV IgM和HEV IgG抗體陽性率分別為7.6%和1.8%，HEV核酸陽性率為7.6%，表明HEV感染是西藏藏豬一個嚴峻的地方性問題[12-13]。然而，關于HEV在藏豬中流行的信息依然有限，且藏豬HEV的分子遺傳信息相對較少。因此，本試驗對藏豬HEV的遺傳多樣性和進化關系進行了調查分析。甘孜州地處川西北高原藏區，飼養管理水平低，衛生環境差，水源污染嚴重等問題極易將病毒傳染給其他動物[14]。然而在本試驗中，藏豬糞便樣本HEV核酸陽性率為16.59%(38/229)，明顯高于西藏藏豬核酸陽性率7.6%(26/340)，這一結果表明，在甘孜州藏豬感染HEV更為普遍嚴重，戊型肝炎病毒的流行具有區域性[15]，提示相關部門要重視甘孜州藏豬HEV的防控及流行情況。意大利研究者發現，83例豬腹瀉糞便樣本中HEV的檢出率(51.1%)明顯高于159只臨床健康豬糞便的檢出率(13.8%)[16]。我國的一項研究發現，兔子經試驗感染HEV毒株可引發腹瀉[17]。已有文獻報道顯示，藏豬腹瀉是常見病[18-19]。在本試驗中，腹瀉糞便中HEV的陽性率(24.14%)顯著高于臨床健康豬糞便樣本陽性率(3.57%)，提示HEV感染可能是導致藏豬腹瀉的原因。因此，鑒定與腹瀉相關的HEV毒株具有重要意義。

ORF2為主要的結構基因編碼區，其核苷酸序列也最為保守，ORF2蛋白是HEV復制、傳染性和免疫反應性的關鍵蛋白，存在多個抗原表位，是誘導機體產生中和抗體的重要抗原表位，是目前疫苗和診斷試劑研發的主要研究抗原片段[4]，因此研究ORF2基因具有重要的理論意義和實踐指導價值。在本試驗中38株藏豬源HEV毒株ORF2部分序列彼此之間核苷酸序列相似性為76.1%～100.0%，與基因4型參考毒株的核苷酸序列相似性最高為75.8%～97.6%，38株藏豬HEV毒株均屬于基因4型，其中亞型4a占優勢，亞型4b、4d和4j占少數；系統進化樹分析顯示，本試驗獲得的基因4型毒株與人源的毒株的進化關系較近。基因4型是近年來人主要感染的基因型，它也存在于當地的豬群中，有研究者報道四川地區生豬HEV流行毒株也是以基因4型為主[20]，人基因4型毒株的基因組序列與從同一地理區域獲得的豬源基因4型毒株的基因組序列密切相關，序列相似性分析和進化樹再次從基因水平提供了戊型肝炎是人獸共患病的證據[21]，具有較大的人獸共患風險。本試驗結果表明甘孜州藏豬源HEV流行情況嚴重，以基因4型流行為主，相關部門應該加強HEV在人和畜禽之間傳播的綜合防控，其具有重要的公共衛生學意義。