蘭州烤羊肉中腐敗微生物的分離與鑒定

◎ 尚潔昊，常程程，丁梓雪，孟憲剛

（蘭州交通大學，甘肅 蘭州 730000）

蘭州處于我國西北地區，多民族聚居，飲食結構多元化，甘肅又是我國的養殖業大省，每年有20多萬噸羊肉被本地消費[1]。羊肉制品中，烤羊肉是深受人們喜歡的品類。烤羊肉串是將新鮮的羊肉除去筋膜，將血水洗凈，切成小塊，經過調味料腌漬后串烤而成。由于烤羊肉串即食的特征，使國內對烤羊肉串的防腐保鮮研究較少，這也限制了烤羊肉串的產業化發展。烤羊肉屬于低溫肉制品，低溫肉制品是一類在標準大氣壓下通過熏、煮、烤和蒸等烹飪工藝處理后，使肉制品的中心部位的溫度達到75～85 ℃的新型肉類制品[2]。低溫肉制品保持了肉本身的組織與結構和其天然的成分，正是這種肉制品的特性，使它成為我國肉制品未來進步的方向和趨勢。但由于低溫肉制品的加工場所開放、滅菌不完全，致使低溫肉制品非常容易發生腐敗，產品貨架期短，必須采用冷鏈的方式運輸和保存，在很大程度上限制了低溫肉制品的發展[3]。如何在最大程度上抑制或消除腐敗微生物生長繁殖，抑制肉制品當中的各種酶對脂肪酸敗、蛋白質的氧化分解，保持肉制品的原有滋味與營養成分，是低溫肉制品保鮮的主要目標。

肉制品之所以發生腐敗變質，主要是由微生物造成的，致使肉本身的顏色發生變化并出現異味，影響肉制品的食用。還有些微生物會把肉中的蛋白質逐漸分解成其他化合物，產生氣味，進一步促使肉制品的腐敗變質[4]。目前，國內外一些研究人員針對低溫肉制品品質低、產品保水能力低、保油能力低、色澤不持久和產品貨架期短等問題，進行了腐敗菌分布、生長衰退規律及優勢腐敗菌的分離鑒定。劉彩云等人[5]發現魏斯氏菌和佐氏庫特氏菌這兩種菌是導致市售鹵牛肉腐敗的優勢菌。宋相宇等人[6]采用高通量測序技術，探究了不同包裝及儲存溫度對于白切雞中微生物菌群結構的影響，發現白切雞優勢菌屬都是假單胞菌屬。

由于低溫肉制品殺菌工藝和儲藏條件與新鮮胴體、高溫肉制品有很大不同，本研究試從市售烤羊肉中分離出導致烤羊肉腐敗的微生物，并對腐敗菌進行鑒定，以確定導致市售燒烤羊肉腐敗的主要微生物，意在為烤羊肉制品的儲存、延長貨架期等問題的解決提供借鑒，也能更好地將當地特色的烤肉制品推廣銷售至全國，拓展銷路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蘭州市安寧區某烤肉店烤制的羊肉串。

FA2004N電子分析天平（上海精密科學儀器有限公司）、DHP-9012電熱恒溫培養箱（上海一恒科學儀器有限公司）、SW-CJ-2G型雙人凈化工作臺（蘇州凈化設備有限公司）、LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋（上海申安醫療器械廠）、SHA-B雙功能水浴恒溫振蕩器（常州天瑞儀器有限公司）、TGL-16G離心機（上海安亭科學儀器廠）和T100PCR儀（伯樂）。

1.2 培養基

LB固體培養基：酵母提取物5 g，胰蛋白胨10 g，氯化鈉10 g，瓊脂粉20 g，蒸餾水1 L。

察氏固體培養基：硝酸鈉3 g，磷酸氫二鉀1 g，硫酸鎂0.5 g，氯化鉀0.5 g，硫酸亞鐵0.01 g，蔗糖30 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 L。

高氏固體培養基：淀粉20 g，硝酸鉀1 g，磷酸氫二鉀0.5 g，氯化鈉0.5 g，硫酸鎂0.5 g，硫酸亞鐵0.01 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 L。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集

樣品采集于蘭州市安寧區某燒烤店，將烤制完成的羊肉用真空包裝袋真空包裝，并標記樣品名稱，放置常溫保存。

1.3.2 燒烤肉制品污染微生物的培養

在超凈工作臺上，取5 g肉樣剪碎，放進含有45 mL無菌生理鹽水的錐形瓶內。通過充分振蕩制成的1∶10均勻稀釋液。按照腐敗情況進行梯度稀釋，稀釋為10-1～10-6。將稀釋后的溶液吸取200 μL，分別加到1.2中3種固體培養基中，進行涂布，之后放在恒溫培養箱32 ℃，培養48 h。

在778份樣本中，共檢出10份HPV18陽性，檢出率1.3%（10/778），其中4份為多重感染。HPV18感染者年齡最小31歲，最大58歲，中位年齡40歲。

1.3.3 燒烤肉制品的污染微生物的分離與純化

將3種培養基上生長的微生物菌落挑出單菌落，反復劃線進行純化。觀察記錄菌株的形態、邊緣、顏色和透明度、菌體是否隆起等生物學性狀。

1.3.4 DNA的提取

模板的獲取：在超凈工作臺中，用接種環分別挑取單菌落到0.2 mL離心管中，加入10 μL無菌水，標記，96 ℃煮沸10 min，迅速放于-20 ℃冷凍5 min（循環3次），4 000 r·min-1離心1 min，吸取2 μL上清液作為DNA模板。

PCR參數：94 ℃預變性5 min；主循環94 ℃變性0.5 min；55 ℃退火1.5 min；72 ℃延伸1.5 min；循環30次；72 ℃終延伸10 min；4 ℃保存。

引物為16S rDNA通用引物27F和1492R，以菌體的DNA為模板進行PCR擴增。反應體系如表1。

表1 PCR反應體系表（25 uL）

1.3.5 16S rDNA測序

將擴增出菌株的DNA片段送到生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。

將測序獲得16S rDNA序列與NCBI數據庫中的序列進行BLAST比對分析，后選取近似菌種序列采用MAGE 7.0軟件構建系統發育樹。

2 結果與分析

2.1 腐敗菌株的菌落特征

經過梯度稀釋涂布和多次劃線培養，在LB瓊脂培養基上篩選得到3株菌株，分別命名為Y1、Y2、Y3號菌。LB瓊脂培養基上菌落形態見表2。

表2 LB瓊脂培養基上菌落形態表

2.2 腐敗菌的革蘭氏染色鑒定結果

革蘭氏染色是細菌學中廣為采用鑒別細菌的一種方法，根據細菌細胞壁的主要成分的不同，通過染色結果可使細菌分為兩大類，即G+與G-[7]。在分離純化試驗中，在腐敗的燒烤羊肉中分離純化出3株菌，采用革蘭氏染色法將這3個菌株進行革蘭氏染色，用100倍油鏡觀察。菌體染色結果均為革蘭氏陽性菌。Y1、Y2呈桿狀，Y3呈短桿狀，橢圓、兩端鈍圓。

2.3 腐敗菌的分子生物學鑒定結果

由圖1可知Y1為地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）、Y2為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、Y3為暹羅芽孢桿菌（Bacillus siamensis）。

圖1 基于16S rDNA序列同源性的菌株的系統發育樹圖

3 結論與討論

以往研究證實，影響低溫肉制品貨架期的關鍵因素是腐敗菌的生長繁殖[8]。低溫肉制品由于制作過程溫度低，殺菌不完全，導致肉制品中會殘有細菌芽胞、真菌孢子和部分耐熱細菌等微生物，在日后的貯存和銷售過程中，存留的微生物在肉中經過短暫的修養、復蘇后將會再次進行生長繁殖，最后會引起肉制品的感官品質下降、導致其腐敗變質，影響了肉制品貨架期[9]。本實驗結果發現，在市場出售的燒烤羊肉制品中，芽孢桿菌是導致烤羊肉腐敗的主要腐敗菌。燒烤肉制品在制作過程中，高溫處理雖能夠殺死一部分不耐熱的微生物，但有些細菌的芽孢仍能在高溫處理下存活下來。當然也存在一些由于烤制不徹底而殘留在肉制品內部的微生物。因此，導致燒烤羊肉制品腐敗的優勢菌大多為芽孢桿菌，這一結果與其他學者在傳統菜肴中分離鑒定出的優勢腐敗菌一致[10-11]。

本研究對常溫條件下市售烤制羊肉中的腐敗菌進行分離純化，并通過菌落形態學觀察和16S rDNA分子鑒定等方法，對肉中的腐敗菌進行了分離鑒定。結果表明，在烤羊肉上分離得到Y1、Y2、Y3 3株菌，分別是地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、暹羅芽孢桿菌。這些腐敗菌主要是由會產生芽孢的芽孢桿菌組成的，是引起燒烤羊肉腐敗的主要菌株，同時也是影響產品貨架期的先決條件。本研究為燒烤羊肉制品加工、貯藏過程中有針對性地控制微生物污染提供借鑒和參考，并且為下一步防腐保鮮提供可用的方法，也為延長燒烤羊肉制品的貨架期提供了理論根據。