高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜法同時測定雞蛋中磺胺和硝基咪唑類藥物殘留

◎ 唐韻熙，白亞敏

（重慶市食品藥品檢驗檢測研究院，重慶 401121）

雞蛋作為大眾消費產(chǎn)品，已成為家家戶戶必備膳食。近年來，“獸藥雞蛋”層出不窮，全國各地都相應(yīng)在雞蛋中檢測出磺胺類、硝基咪唑類、氯霉素類和喹諾酮類藥物，這無疑影響著人們的身體健康[1-3]。甲硝唑和地美硝唑作為廣譜抗菌藥，能夠有效驅(qū)除動物體內(nèi)的寄生蟲，在養(yǎng)殖過程中投喂該類藥物不僅可以有效殺菌，同時也能作為家禽的生長促進(jìn)劑[4-5]。磺胺類藥物（Sulfonamides，SAs）是指含有對氨基苯磺酰胺的一類藥物的總稱，被廣泛用于畜禽生產(chǎn)，特別是養(yǎng)殖密度較大的家禽行業(yè)中，以防治細(xì)菌感染。消費者在不知情的情況下長期食用含有硝基咪唑類和磺胺類藥物的雞蛋，人體會產(chǎn)生一定的抗藥性，影響身體健康[6-8]。楊修鎮(zhèn)等[9]指出雞蛋中磺胺類、硝基咪唑類藥物的檢出率因產(chǎn)蛋期的非法用藥而呈現(xiàn)不規(guī)律性。

《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中獸藥最大殘留限量》（GB 31650—2019）規(guī)定磺胺類以及磺胺二甲嘧啶在產(chǎn)蛋期禁用，《動物性食品中獸藥最高殘留限量》中規(guī)定，甲硝唑和地美硝唑允許作為治療用，但不得在動物性食品中檢出。目前，磺胺類藥物、甲硝唑及地美硝唑的檢測方法主要有液相色譜法[10-12]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測法[13-15]、高效毛細(xì)管電泳法[16-17]以及酶聯(lián)免疫法[18-19]等，但是檢測方法大多數(shù)僅包含一種類型的化合物，不能滿足市場需求。本研究通過建立同時檢測雞蛋中磺胺類化合物和硝基咪唑化合物多殘留高通量檢測方法，能夠?qū)崿F(xiàn)大批量樣品高效、準(zhǔn)確測定，同時也能對雞蛋的獸藥殘留問題起到技術(shù)監(jiān)管作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲醇、乙腈（質(zhì)譜純，德國Merck公司）；正己烷（色譜純，美國Honeywell公司）；乙酸乙酯（色譜純，美國Honeywell公司）；甲酸（質(zhì)譜純，美國Sigma公司）；無水硫酸鈉（分析純，重慶川東化工有限公司）；實驗室用水為Milli-Q去離子水（美國MIllipore公司）。

甲硝唑、地美硝唑、地美硝唑-D3、磺胺喹惡啉、磺胺地索辛、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺嘧啶、磺胺甲惡唑和磺胺甲氧噠嗪標(biāo)準(zhǔn)品購于德國Dr.Ehrenstorfer公司，甲硝唑-D4標(biāo)準(zhǔn)品購于BePure公司，各標(biāo)準(zhǔn)品純度均≥95%。

標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液的配制：分別準(zhǔn)確稱取甲硝唑、甲硝唑-D4、地美硝唑、地美硝唑-D3、磺胺喹惡啉、磺胺地索辛、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺嘧啶、磺胺甲惡唑和磺胺甲氧噠嗪各10.00 mg于10 mL容量瓶中，甲醇溶解定容，配制成質(zhì)量濃度分別為1.000 mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，存儲于-20 ℃冰箱中，有效期為12個月。

甲硝唑-D4和地美硝唑-D3混合內(nèi)標(biāo)工作溶液配制：分別準(zhǔn)確移取1.000 mg·mL-1甲硝唑-D4和地美硝唑-D3儲備液各0.1 mL，置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成10 μg·mL-1的混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作液1，存儲于-20 ℃冰箱中，有效期為3個月；準(zhǔn)確移取0.1mL 10 μg·mL-1的混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作液1，置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成100 ng·mL-1的混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作液2，現(xiàn)配現(xiàn)用。

樣品雞蛋購于超市；陰性雞蛋來源于日常監(jiān)督檢驗不含目標(biāo)化合物的樣品。

1.2 儀器與設(shè)備

安捷倫1290液相色譜儀（美國安捷倫公司）；AB SCIEX 5500三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國AB SCIEX公司）；3-30KS型冷凍離心機(jī)（德國Sigma公司）；ML-886渦旋儀（海門市其林貝爾儀器）；Turbovap LV全自動濃縮儀（英國Biotage公司）；超純水系統(tǒng)Milli-q reference 型純水機(jī)（美國MILLIPORE）；MSA225S-100-DU電子分析天平（十萬分之一，德國Sartorius公司）。

1.3 方法

1.3.1 提取溶劑的優(yōu)化

稱取5 g均質(zhì)的雞蛋樣品于50 mL聚丙烯離心管中，加入100 ng·mL-1甲硝唑-D4和地美硝唑-D3混合內(nèi)標(biāo)工作溶液50 μL，分別使用20 mL乙腈、0.1%甲酸乙腈、乙酸乙酯和0.1%甲酸-乙酸乙酯溶液提取，振蕩渦旋5 min，加入5 g無水Na2SO4，迅速振搖，于8 000 r·min-1離心10 min，轉(zhuǎn)移上清液至干凈玻璃管中，40 ℃氮吹干，加入1 mL 20%甲醇復(fù)溶，2 mL正己烷除脂，渦旋30 s，8 000 r·min-1離心5 min，去掉正己烷層，下層溶液重復(fù)用正己烷除脂1次，取下層清液過0.22 μm濾膜，待測。

1.3.2 液相色譜與質(zhì)譜條件的優(yōu)化

（1）液相色譜條件。色譜柱：A大寫 UPLCBEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；柱溫：40 ℃；流速為0.3 mL·min-1；進(jìn)樣量：2 μL。比較乙腈-0.1%甲酸水、甲醇-0.1%甲酸水、甲醇-水分別作為流動相對目標(biāo)化合物分離效果的影響，從而選取最優(yōu)流動相體系。

（2）質(zhì)譜條件。電噴霧（ESI）離子源，正離子模式；掃描模式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；離子源溫度：550 ℃；離子源電壓：5 500 V；氣簾氣壓力：35 psi；GAS1：55 psi，GAS2：55 psi；選定10種目標(biāo)化合物的監(jiān)測離子對，優(yōu)化去簇電壓（DP）和碰撞能（CE）。

1.3.3 基質(zhì)效應(yīng)的確定

用經(jīng)樣品前處理（1.3.1）后的陰性基質(zhì)樣液配制目標(biāo)化合物標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.3.2條件進(jìn)行測定，以目標(biāo)物的濃度（X，ng·mL-1）與相應(yīng)的峰面積（Y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率與純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)曲線的斜率之比考察雞蛋中10種化合物的基質(zhì)效應(yīng)。

1.3.4 方法學(xué)驗證

（1）線性范圍及靈敏度。在經(jīng)1.3.1方法處理后的雞蛋空白基質(zhì)提取液中加入適量磺胺類化合物和硝基咪唑類化合物混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液及兩種混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制成濃度為2 ng·mL-1、5 ng·mL-1、10 ng·mL-1、20 ng·mL-1、50 ng·mL-1和100 ng·mL-1（8種 磺 胺 類 化 合 物）和1 ng·mL-1、2 ng·mL-1、5 ng·mL-1、10 ng·mL-1和20 ng·mL-1（2種硝基咪唑類化合物）的基質(zhì)加標(biāo)溶液，依次進(jìn)樣，以目標(biāo)物的濃度（X，ng·mL-1）與相應(yīng)的峰面積（Y）進(jìn)行線性回歸，1/x為權(quán)重，計算雞蛋陰性基質(zhì)中添加標(biāo)準(zhǔn)品的信噪比，以S/N≥10作為方法定量限。

（2）回收率與精密度。在陰性雞蛋樣品中分別添加0.2 μg·kg-1、0.4 μg·kg-1、2.0 μg·kg-1含量的甲硝唑、地美硝唑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，0.5 μg·kg-1、1.0 μg·kg-1、5.0 μg·kg-1含量的磺胺類化合物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照本方法平行測定6次，連續(xù)測定3 d，計算加標(biāo)回收率以及批內(nèi)、批間標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

將系列標(biāo)準(zhǔn)溶液、樣品溶液按優(yōu)化后的儀器方法上機(jī)進(jìn)行測定，采用MultiQuant 3.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取條件的確定

雞蛋中水分較多，并且具有蛋白質(zhì)、脂類等物質(zhì)，本文比較乙腈、0.1%甲酸乙腈、乙酸乙酯和0.1%甲酸-乙酸乙酯作為提取溶劑對10種目標(biāo)化合物提取效率的影響。經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)，乙腈雖然具有沉淀蛋白的作用，但是氮吹速度慢，提取時長為乙酸乙酯的2倍，不適合大批量樣品處理，且最后經(jīng)正己烷凈化后目標(biāo)層液體不易澄清。綜合10種化合物的提取效率，以含有0.1%甲酸的乙酸乙酯最優(yōu)（見圖1），回收率為73%～109%，滿足試驗要求。所以最后選擇0.1%甲酸-乙酸乙酯為該方法的提取溶劑。

圖1 不同提取溶劑對10種化合物提取效率的影響圖（n=6）

2.2 液相色譜與質(zhì)譜條件的確定

2.2.1 色譜條件優(yōu)化

選用Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱，比較乙腈-0.1%甲酸水、甲醇-0.1%甲酸水、甲醇-水分別作為流動相對目標(biāo)化合物分離效果的影響。結(jié)果表明，10種化合物在以甲醇和水作為流動相，靈敏度最好，但是色譜峰型以乙腈-0.1%甲酸水最優(yōu)，可能是由于磺胺類化合物的結(jié)構(gòu)帶氨基，呈弱堿性，在水中加入0.1%甲酸有助于待測物的母離子[M+H]+的形成，提高離子化效率，硝基咪唑類化合物在酸性條件下也可以改善峰型。

在1.3.2條件下，雞蛋陰性基質(zhì)中添加濃度為5 ng·mL-1的10種化合物的總離子流圖見圖2。地美硝唑和磺胺嘧啶、磺胺甲氧噠嗪和磺胺二甲嘧啶、磺胺間二甲氧嘧啶和磺胺喹惡啉分別有相同的保留時間，但是由于其化合物的母離子與特征碎片離子不同，因此可以較好區(qū)分。最終在滿足檢測要求的情況下，選擇乙腈-0.1%甲酸水作為流動相，流動相梯度為：流動相A 0.1%甲酸水溶液；流動相B 乙腈。梯度洗脫程序：0～0.5 min，10%B；0.5～3.0 min，10%B→90%B；3.0～5.0 min，90%B；5.0～5.1 min，90%B→10%B；5.1～7.0 min，10%B。

圖2 陰性基質(zhì)中10種化合物（5 ng·mL-1）的總離子流圖

2.2.2 質(zhì)譜條件優(yōu)化

磺胺類化合物和硝基咪唑類化合物結(jié)構(gòu)中分別含有磺酰胺基、硝基、咪唑環(huán)等供電基團(tuán)，該試驗選擇正離子模式電離，對濃度為20 ng·mL-1的10種化合物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行一級質(zhì)譜掃描，優(yōu)化去簇電壓（DP），確定[M+H]+母離子。通過優(yōu)化碰撞能（CE）將母離子碰撞產(chǎn)生碎片離子進(jìn)行二級質(zhì)譜掃描，經(jīng)試驗優(yōu)化，10種化合物的定性和定量特征離子及優(yōu)化質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 10種化合物的質(zhì)譜參數(shù)表

2.3 基質(zhì)效應(yīng)

雞蛋中含有較豐富的蛋白質(zhì)、脂肪，特別是磷脂類化合物，若這些物質(zhì)與目標(biāo)化合物共流出，會使定性定量結(jié)果不準(zhǔn)確，而使用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行校準(zhǔn)能夠減小基質(zhì)效應(yīng)。本試驗利用雞蛋陰性基質(zhì)配制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率與純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)曲線的斜率之比考察雞蛋中10種化合物的基質(zhì)效應(yīng)，比值小于1為基質(zhì)抑制，比值大于1為基質(zhì)增強(qiáng)[20-21]。10種化合物的斜率比值見圖3。結(jié)果表明，磺胺間甲氧嘧啶、磺胺甲惡唑、磺胺地索辛、磺胺喹惡啉、磺胺嘧啶和地美硝唑受基質(zhì)效應(yīng)影響較大。其中除磺胺嘧啶呈基質(zhì)增強(qiáng)，其余均為基質(zhì)抑制。故本研究最終采用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線來提高試驗的準(zhǔn)確性。

圖3 10種化合物的基質(zhì)效應(yīng)圖

2.4 方法學(xué)評價

結(jié)果表明，10種化合物得到的線性關(guān)系良好（見表2），磺胺類化合物的定量限為0.5 μg·kg-1，硝基咪唑的定量限為0.2 μg·kg-1，滿足檢測要求。由表3可知，10種化合物的平均回收率范圍為66.3%～107.9%，批內(nèi)精密度范圍為3.5%～15.0%，批間精密度范圍為3.8%～13.0%，該方法靈敏度較好，準(zhǔn)確度以及精密度較高。

表2 10種化合物的線性關(guān)系、儀器定量限、保留時間表

表3 10種化合物的平均加標(biāo)回收率、RSD表

2.5 實際樣品檢測

利用本文建立的分析方法，對市場上近500余批雞蛋進(jìn)行測定。其中陽性樣品有19批，不合格化合物主要是磺胺嘧啶（6批次，檢出含量為14.93～1 162.95 μg·kg-1）、磺胺間甲氧嘧啶（4批次，檢出含量為8.99～75.05 μg·kg-1）、磺胺二甲嘧啶（2批次，檢出含量為220.10～935.44 μg·kg-1）、甲硝唑（3批次，檢出含量為5.86～2 150.30 μg·kg-1）和地美硝唑（4批次，檢出含量為8.8～64.0 μg·kg-1）。本分析方法適合大批量樣品的定性和定量分析檢測。

3 結(jié)論

本文通過優(yōu)化提取溶劑、色譜-質(zhì)譜條件，并進(jìn)行方法學(xué)驗證，建立了高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時檢測雞蛋中8種磺胺類化合物和2種硝基咪唑類化合物。本研究的方法靈敏度高、選擇性好、前處理方法簡單，線性關(guān)系、回收率等方法學(xué)指標(biāo)較好，分析時間短，能夠同時檢測兩種類型的雞蛋獸藥殘留物。后續(xù)研究還將進(jìn)一步優(yōu)化前處理方法，擴(kuò)大適用范圍，分析多種動物源性食品中磺胺類化合物和硝基咪唑類化合物的檢測方法。