巨囊性病液狀蛋白-15在肺癌中的表達研究

周 爽 蘇小珊 林國福 劉怡飛 高宏志

福建醫科大學附屬第二醫院臨床分子診治研發中心，福建泉州 362000

肺癌對于當今世界來說，仍是一個嚴峻的挑戰，在臨床當中， 肺癌的發病率和病死率都高居癌癥首位，而且已經呈現出逐年上升的趨勢[1]。 巨囊性病液體蛋白-15（gross cystic disease fluid protein 15，GCDFP-15）又名泌乳素誘導蛋白（prolactin-inducible protein，PIP），是一個約17 kDa 的蛋白， 由許多正常的大泌腺細胞分泌，存在于精漿、唾液、淚液、眼淚、汗腺中。GCDFP-15 在乳腺癌中廣泛表達， 作為該疾病的組織病理學診斷標志物[2-4]。 純化的GCDFP-15 可促進乳腺癌細胞的生長[3]。除了細胞增殖，GCDFP-15 介導了乳腺癌細胞的侵襲， 這一過程部分依賴于其天冬氨酸蛋白酶活性[5]。

GCDFP-15 雖然是一個小蛋白，但其生物功能多樣，已知其在免疫調節、生育力、抗菌活性、細胞凋亡和腫瘤進展中起著至關重要的作用。一方面它可與T 淋巴細胞、巨噬細胞和精子表面的CD4 受體結合[6]。另一方面，GCDFP-15 具有免疫調節功能，GCDFP-15缺乏的小鼠出現淋巴器官出現異常[7]。 GCDFP-15 與來自幾個屬的細菌結合，這表明這種糖蛋白也可能參與先天免疫和保護宿主免受微生物感染。 其次，GCDFP-15 具有天冬氨酸蛋白酶活性，可降解纖維連接蛋白，提示其在惡性腫瘤進展中的重要作用[3]。

在腫瘤研究中，GCDFP-15 乳腺癌和前列腺癌的增生和轉移過程起作用[8-10]，且在乳腺癌中的過表達與癌的預后有關。除了乳腺癌和前列腺癌，GCDFP-15在其他惡性腫瘤中也有異常的表達[11-13]。 GCDFP-15也被用于區分口腔、乳腺和結腸的原位腫瘤[14]。 研究顯示，GCDFP-15 提示胰腺癌、 肝癌與乳腺癌的轉移[3，13，15]。 免疫組織化學法顯示GCDFP-15 在腦的腺癌和肺上皮癌也有過表達[8，16]。 此外，GCDFP-15 還被用于識別來源于乳腺癌的肺轉移癌[3，8]。GCDFP-15 在圓錐角膜中的潛在治療作用被確定[17-18]。 盡管如此，GCDFP-15 在乳腺癌以外的癌癥中的作用研究較少，在肺癌中更少。早期研究GCDFP-15 在正常支氣管黏膜下腺和支氣管上皮中表達，而在肺癌中的作用和表達情況并不清楚。本研究旨在檢測肺癌及正常對照組血漿中的GCDFP-15 蛋白水平以及肺癌細胞系、支氣管上皮細胞系中的GCDFP-15 mRNA 和蛋白水平，探討GCDFP-15 在肺癌中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019年10月至2020年10月福建醫科大學附屬第二醫院收治的54 例肺癌患者作為研究對象，其中男34 例（62.96%），女20 例（37.04%）；年齡44～89 歲；鱗癌22 例（40.74%），腺癌32 例（59.26%）。納入標準： ①患者經手術組織病理檢驗證實為肺癌；②患者對本研究知情同意并簽署知情同意書。排除標準：①合并其他腫瘤或精神障礙者；②術前接受過局部放療、全身化療或其他抗腫瘤治療者；③資料不完整者。本研究經福建醫科大學附屬第二醫院倫理委員會審核批準。選取同期21 例體檢健康者，其中男13例（61.90%），女8 例（38.10%），平均年齡（39.63±3.52）歲。納入標準：①年齡18～55 歲的健康成年人；②無腫瘤或其他慢性病，2年內常規體檢指標均正常者。 用酶聯免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）檢測所有受試者血漿中的GCDFP-15。

從上海細胞庫購置5 株細胞系， 用于培養和檢測。 細胞系信息見表1。

表1 細胞系信息

1.2 方法

1.2.1 基于癌癥基因組圖譜（the cancer genome atlas，TCGA）數據庫分析肺癌中的泌乳素誘導蛋白的表達差異 從生物信息數據庫TCGA 中的腫瘤大數據分析網站GEPIA 中查詢GCDFP-15 在肺癌組織和癌旁組織中的表達（癌旁組織59 例，肺癌組織515 例），同時分析GCDFP-15 不同表達水平的肺癌患者的預后情況。 依據肺癌分型，對肺腺癌（lung adenocarcinoma，LUAD）和肺鱗癌（lung squamous cell carcinoma，LUSC） 分別查詢GCDFP-15 在癌組織與癌旁組織中的表達差異。

1.2.2 ELISA 將入組的血漿樣本50 μl 及試劑盒配備的標準品嚴格按照GCDFP-15 ELISA 試劑盒（上海江萊生物科技有限公司；貨號：JL14570）說明書進行實驗。 Thermo Scientific Multiskan Sky 全波長酶標儀檢測450 nm 波長的OD 值，所得數據依照試劑盒說明書的方法在Curve Expert 1.4 中進行分析計算， 并用GraphPad Prism 7.0 進行數據可視化和統計學分析。

1.2.3 細胞系與培養 H1975、H520、H460、A549 以及16HBE 細胞在含有1%雙抗、10%胎牛血清的DMEM培養液，37℃、5%CO2保持飽和濕度培養， 隔天換液，待細胞密度80%～90%時常規傳代。

1.2.4 Western blot 各組6 孔細胞培養板中的細胞傳代2 次后，收集對數生長期的細胞，用蛋白提取試劑盒（Solarbio Life Science；貨號：BC3711）提取總蛋白， 提取的總蛋白經BCA 蛋白質定量試劑盒（Solarbio Life Science；貨號：PC0020）測定其蛋白濃度， 取50 μg 總蛋白樣品進行SDS-PAGE 分離蛋白質，電泳結束后轉膜于PVDF 膜，經5%脫脂牛奶室溫封阻2 h 后， 按抗體說明書的稀釋比稀釋一抗GCDFP15 （Abcam 公司； 貨號：ab133290） 和內參α-Tubulin（Abcam 公司； 貨號：ab7291），4℃搖動孵育過夜，加抗兔/鼠二抗，室溫下搖動1.5 h，用1×TBST 緩沖液洗3 次，每次5 min，ECL 化學曝光顯影。 將膜置于GE Image Quant LAS4000 mini 成像系統上掃描目的條帶和內參條帶，經Image J 系統分析GCDFP15 和內參α-Tubulin 蛋白表達量。

1.2.5 定量逆轉錄PCR（quantitative reverse transcription PCR，RT-qPCR） 提取細胞中的總RNA，用Thermo Scientific Multiskan Sky 全波長酶標儀測定濃度和純度后備用。 根據逆轉錄試劑盒（Takara；貨號：RR047A）說明書將總RNA 逆轉錄為cDNA。按照TB GreePremix Ex TaqTM試劑盒（Takara；貨號：RR420A）說明書的操作步驟，通過ABI Quant Studio 5 PCR儀檢測GCDFP-15 的mRNA 水 平。GCDFP-15 的正向引物為5′-TCAGGACAACACTCGGAAGA-3′，反向引物為5′-CGTCACATAGGCAGGCAGTA-3′，GAPDH 的正向引物為5′-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3′，反向引物為5′-AGGGGCCATCCAC-AGTCTTC-3′。 qPCR 反應體系包括1 μl cDNA樣品、10 μl TB Green PCR Master Mix 和0.4 μl 正、反向引物。 反應循環條件謹遵TB GreenPremix Ex TaqTM試劑盒（Takara；貨號：RR420A）說明書。 以GAPDH作為內參照， 采用2-ΔΔCT法分析GCDFP-15 mRNA 的表達。

1.3 統計學方法

采用GraphPad Prism 7.0 統計學軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差（±s）表示，兩組間比較采用t 檢驗，多組間比較采用方差分析；計數資料用率表示，兩組間比較采用χ2檢驗，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TCGA 數據庫分析肺癌中的GCDFP-15 的表達差異

2.1.1 LUAD 和LUSC 中腫瘤組織和癌旁組織的GCDFP-15 轉錄組水平的比較 TCGA 轉錄組學數據查詢結果顯示，在肺腺癌中，癌組織與癌旁組織的GCDFP-15 mRNA 比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；肺鱗癌中，癌組織與癌旁組織的GCDFP-15 mRNA 比較，差異無統計學意義（P＞0.05）（圖1）。

圖1 LUAD 和LUSC 中腫瘤組織和癌旁組織的GCDFP-15 轉錄組水平的比較

2.1.2 LUAD 和LUSC 中不同臨床分期患者肺癌組織中GCDFP-15 轉錄組水平的比較 LUSC 中，Ⅰ～Ⅲ期癌組織的GCDFP-15 mRNA 低于癌旁組織， 差異有統計學意義（P＜0.05）；Ⅳ期癌組織與癌旁組織的GCDFP-15 mRNA 比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。LUAD 中，Ⅲ期癌組織中的GCDFP-15 mRNA 與癌旁組織比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ期癌組織的GCDFP-15 mRNA 均高于癌旁組織，差異有統計學意義（P＜0.05）（圖2）。

圖2 LUAD 和LUSC 中不同臨床分期患者肺癌組織中GCDFP-15轉錄組水平的比較

2.1.3 GCDFP-15 高表達肺癌組與GCDFP-15 低表達肺癌組生存期的比較 低表達組的中位生存期為109 個月，高表達組的中位生存期為90 個月，兩組比較，差異無統計學意義（P=0.054）（圖3）。

圖3 GCDFP-15 高表達肺癌組與GCDFP-15 低表達肺癌組生存期的比較

2.2 肺癌與正常對照組血漿中GCDFP-15 濃度的比較

經ELISA 檢測血漿中GCDFP-15 的含量，54 例肺癌患者血漿中的GCDFP-15 含量為（62.12±7.159）ng/ml，高于21 例正常對照組的（42.27±4.21）ng/ml，差異有統計學意義（P＜0.05）（圖4）。 鱗癌組和腺癌組的GCDFP-15 含量比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

圖4 ELISA 方法檢測肺癌患者及正常對照組的血漿GCDFP-15含量

2.3 肺癌細胞系（4 株）與支氣管上皮細胞系（1 株）中GCDFP-15 mRNA 水平的比較

5 株細胞RT-qPCR 檢測GCDFP-15 mRNA 的表達情況，結果如圖5 所示，其中16HBE（人支氣管上皮樣細胞）未檢測到GCDFP-15 mRNA，A549（人非小細胞肺癌細胞）、H520（人肺鱗癌細胞）的GCDFP-15 mRNA 含量高于H460（人大細胞肺癌細胞）、H1975（人肺腺癌細胞），差異有統計學意義（P＜0.05）。4 株肺癌細胞株的GCDFP-15 mRNA 含量均高于16HBE，差異有統計學意義（P＜0.05）。

圖5 RT-qPCR 方法比較5 株細胞系中GCDFP-15 mRNA 的表達差異

2.4 肺癌細胞系（4 株）與支氣管上皮細胞系（1 株）中GCDFP-15 蛋白水平的比較

收集5 株細胞， 采用Western blot 檢測GCDFP-15 及內參tubulin 基因的表達，結果如圖6 所示，7 次檢測，均未能檢測到特異性條帶。

圖6 Western blot 檢測5 株細胞中GCDFP-15 蛋白的表達（重復7 次的結果）

2.5 肺癌細胞系（4 株）與支氣管上皮細胞系（1 株）培養基上清中GCDFP-15 蛋白水平的比較

收集5 株細胞的培養基上清，用ELISA 法檢測其中GCDFP-15 蛋白的含量， 結果顯示A549 和H460細胞培養基上清中的GCDFP-15 蛋白水平均高于16HBE，差異有統計學意義（P＜0.05）；H520、H1975 與16HBE 的GCDFP-15 蛋白水平比較， 差異無統計學意義（P＞0.05）（圖7）。

圖7 ELISA 法檢測5 株細胞系培養基上清中的GCDFP-15 蛋白含量

3 討論

肺癌是全世界癌癥相關死亡的主要原因，非小細胞肺癌（non small cell lung cancer，NSCLC）占肺癌的85%， LUAD 和LUSC是最常見 的NSCLC 類 型。GCDFP-15 在乳腺的病理狀態和一些外分泌組織中表達，如淚腺、唾液腺和汗腺[19]。 其在抗菌、免疫調節及腫瘤進程中均發揮著重要的生物學作用[20]。 研究發現GCDFP-15 在乳腺癌、前列腺癌等惡性腫瘤中出現過表達現象，且提示GCDFP-15 與腫瘤轉移浸潤也有關系[2]。

GCDFP-15 在肺癌中的研究十分有限。Osawa 等[19]利用序列特異性引物對多種組織進行RT-qPCR 檢測，發現GCDFP-15 基因在腦、肺、肝、脾、心臟、骨骼肌、腎、胃、子宮和卵巢中的表達可以忽略不計。 另一方面，它在淚腺、腮腺、舌下、頜下腺、乳腺和精囊中大量表達。 免疫組織化學分析顯示GCDFP-15 在腦腺癌[9]和肺腺癌[21]中過表達。

本研究為明確GCDFP-15 在肺癌中的表達情況，首先利用TCGA 數據庫分析，發現LUAD 和LUSC 中的GCDFP-15 的表達趨勢不同，GCDFP-15 低表達組顯示出比高表達組更高的中位生存期，這是肺癌組織標本的結果，血漿樣本的結果可能不同。 應用ELISA方法檢測肺癌患者及正常對照組的血漿GCDFP-15含量， 發現肺癌組的GCDFP-15 含量高于正常對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。 但是通過血漿提取GCDFP-15 mRNA 得到的是陰性的結果，這很可能是因為該蛋白屬于分泌型，mRNA 并未被轉運到細胞外。文獻報道稱人和嚙齒動物的GCDFP-15 基因在外分泌器官中表達，并通過分泌囊將GCDFP-15 轉移到這些器官的液體分泌物中[20]。因此mRNA 在血漿中本身就幾乎不存在，無法被檢測到。

本研究利用4 株肺癌細胞和1 株支氣管上皮細胞系進行實驗，分別以RT-qPCR 和Western blot 技術檢測細胞中的GCDFP-15 mRNA 和蛋白水平，結果發現4 株肺癌細胞中的GCDFP-15 mRNA 均高于支氣管上皮細胞系， 且不同的肺癌細胞系之間也有差異。但是Western blot 卻得到了陰性的結果，GCDFP-15為特異性囊腫病液體蛋白15，分泌型，分子量約17 kDa，抗體說明書檢測條帶介于15～20 kDa， 檢測難度大。考慮該蛋白分泌至培養基里，本研究嘗試使用ELISA檢測培養基上清中的GCDFP-15 蛋白，得到的結果均為陽性，但是由于培養基內含有胎牛血清，胎牛血清本身是否含有GCDFP-15，值得考量，經文獻調研和血清廠家的咨詢， 均無確鑿的證據表明血清中自帶GCDFP-15，后續實驗可以考慮用無/低血清培養基進行培養，或設置一個放置培養箱中但不鋪細胞的空培養基作為對照組來消除血清干擾的問題。 另外，不同細胞系的大小、生長速度不盡相同，除了控制鋪板時的細胞數，對于檢測GCDFP-15 前的細胞密度不便于統計，所以，在培養基上中檢測GCDFP-15 如何精準定量是個值得思考的問題。后續實驗將從三個方面入手進行優化，以期得到更精準有效的結果：首先，擴大入組樣本量； 其次， 增加肺癌患者的唾液樣本進行GCDFP-15 檢測；最后，在細胞水平的實驗中，努力優化條件（如無血清培養等），力爭更科學、有效地檢測培養基上清液中的GCDFP-15 蛋白。

綜上所述，本研究利用TCGA 數據庫對肺癌組織中的GCDFP-15 轉錄組進行分析，發現GCDFP-15 低表達組顯示出比高表達組更高的中位生存期；結合肺癌患者血漿標本以及肺癌細胞系的檢測結果，初步確定GCDFP-15 在肺癌患者血漿中呈現特異性表達升高的趨勢，提示GCDFP-15 可能是肺癌外周血中的腫瘤標志物，但此次研究樣本量偏小，結論需得到臨床更大樣本量的驗證。