MicroRNA-501-5p在乳腺癌中的作用

李亞南 金春明 宮方巖 高 宇 鄧 夢 張 航 丁鑫哲 尹貴彬

1.牡丹江醫學院第一臨床醫學院，黑龍江牡丹江 157000；2.牡丹江醫學院附屬紅旗醫院檢驗科，黑龍江牡丹江 157000

乳腺癌居女性惡性腫瘤發病率首位，也是女性患癌死亡的主要原因[1]。有研究表明，患有良性乳腺疾病的女性， 在長達15年的時間里都有較高的轉為乳腺癌的風險[2]。MicroRNA（miR）是一種調控分子，可監督各種過程和基因表達，miR 可以通過干擾細胞活動來正向或負向調節乳腺腫瘤形成[3]，因此，miR 顯示出了其用作監測乳腺癌的生物標志屬性。近年國內外研究表明，miR-501-5p 通過多種信號通路在多種癌癥中起重要作用，但在乳腺癌中的作用尚未發現。 哺乳動物LAMTOR5 是一種高度保真的、約18 kDa 的蛋白，其最初被鑒定為乙型肝炎X 蛋白相互作用蛋白（hepatitis B virus X -interacting protein，HBXIP）[4]。LAMTOR5 與致癌基因c-Myc、p53、survivin 相關，可發揮促進癌細胞增殖及抗凋亡作用[5-7]。 miR-501-5p與LAMTOR5 兩者間相關性尚未有研究發現。 本研究旨在通過探討miR-501-5p 在乳腺癌患者組織及血清中的表達水平、LAMTOR5 在乳腺癌組織和癌旁組織中的差異表達以及miR-501-5p 與LAMTOR5 之間的相關性，為乳腺癌的早期臨床診斷提供新思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2020年3月至2021年3月牡丹江市腫瘤醫院收治的40 例初次診斷為乳腺癌的患者為乳腺癌組，收集其初次手術切除的癌組織、癌旁組織及血清，選取同期在牡丹江市牡丹江醫學院附屬紅旗醫院體檢的40 名體檢者為健康對照組，采集其血清。新鮮組織標本于液氮中轉運，保存于-80℃冰箱。乳腺癌組中，平均年齡（54.15±10.99）歲；健康對照組均為女性，平均年齡（53.13±8.09）歲，兩組的一般資料比較，差異無統計學意義（P>0.05），具有可比性。 本研究經醫院倫理委員會審核批準且所有患者及家屬均簽署知情同意書。

納入標準：①所有乳腺癌患者首次經病理組織活檢診斷為原發性乳腺癌；②乳腺癌患者手術切除病灶前未接受放療及化療等治療措施；③乳腺癌患者臨床病歷資料完備； ④健康體檢者過去3 個月無癌癥史，無住院治療記錄，無其他良性乳腺疾病；⑤健康體檢者未處于孕期或哺乳狀態。

排除標準： ①患有其他慢性疾病及其他腫瘤患者；②非女性患者。

臨床數據癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）表達水平、糖類抗原153（carbohydrate antigen，CA153）表達水平、糖類抗原125（carbohydrate antigen，CA125）表達水平、人類表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，Her-2）表達情況、雌激素受體（estrogen receptor，ER）表達情況、孕激素受體（progesterone receptor，PR）表達情況來自醫院病理數據。

1.2 主要試劑及設備

Trizol 總RNA 提取試劑（批號：Lot20210525C）、miR-501-5p SYBR 兩步法試劑盒（批號：Lot20210625）均購自上海艾博思生物科技有限公司；PCR 儀（型號：MX3000P）購自美國Aligent Stratagene 公司；LAMTOR5抗體（貨號：14492-1-AP）購自武漢三鷹生物有限公司；脫水機（型號：JT-12J）、包埋機（型號：JB-L5）購自武漢俊杰電子有限公司；顯微鏡（型號：eclipse Ci-e）購自日本尼康公司。

1.3 方法

1.3.1 MiR-501-5p 檢測 實時熒光定量PCR（real-time quantitative PCR，qRT-PCR）法檢測乳腺癌組織、癌旁組織、 實驗組血清及對照組血清中miR-501-5p 水平，先經總RNA 提取試劑盒（Trizol 法）提取血清總RNA， 經反轉錄試劑盒轉錄為cDNA， 再進行qRTPCR 反應。 qRT-PCR 反應條件：94℃預變性3 min，94℃變性20 s，62℃退火40 s，72℃延伸40 s，共40 個循環，采用2-△CCT計算miR-501-5p 表達量。

1.3.2 LAMTOR5 定性檢測 采用免疫組織化學技術定性檢測乳腺癌組織及癌旁組織中LAMTOR5 表達情況。 組織制成切片后烘干，二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫水、3%過氧化氫水溶液中孵育、PBS 洗滌3 次， 再將切片置于檸檬酸抗原修復緩沖液中修復抗原、PBS 洗滌滴加封閉液后室溫封閉。 滴加一抗， 陰性對照以PBS 代替，切片置于濕盒內4℃孵育過夜。 PBS 洗滌、滴加二抗，室溫孵育。 PBS 洗滌后滴加DAB 顯色液，顯微鏡下觀察顯色情況，見棕黃色即蒸餾水沖洗切片終止染色。 蘇木精復染3 min、鹽酸酒精分化、蒸餾水沖洗、梯度乙醇脫水、中性樹膠封片。

1.4 觀察指標及評價標準

①比較乳腺癌患者癌組織與癌旁組織的miR-501-5p 表達水平；②比較乳腺癌組和健康對照組的血清miR-501-5p、CEA、CA153、CA125 表達水平；③比較不同臨床特征乳腺癌患者血清中miR-501-5p 的表達水平；④LAMTOR5 在乳腺癌組織和癌旁組織中表達情況；⑤LAMTOR5 和miR-501-5p 在乳腺癌組織中表達的相關性；⑥判斷miR-501-5p 的診斷效能，繪制ROC 曲線，ROC 曲線是反映敏感性和特異性連續變量的指標， 以敏感度為縱坐標，（1-特異度）為橫坐標繪制成曲線，AUC 越接近1，診斷準確性越高。

1.5 統計學方法

采用SPSS 25.0 統計學軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差（±s）表示，兩組間比較采用t 檢驗；計數資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗；相關性分析采用Spearman 檢驗； 繪制ROC 曲線判斷miR-501-5p 的診斷效能；以P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 乳腺癌組織與癌旁組織中miR-501-5p 表達水平的比較

miR-501-5p 在乳腺癌組織中的表達水平為（1.12±0.23），在癌旁組織中的表達水平為（0.96±0.15），其在乳腺癌組織中的表達水平高于癌旁組織，差異有統計學意義（P<0.05）（圖1）。

圖1 乳腺癌組織與癌旁組織中MiR-501-5p 表達水平的比較

2.2 乳腺癌組與健康對照組血清中miR-501-5p 表達水平的比較

乳腺癌組血清中miR-501-5p 的表達水平為（0.96±0.17），健康對照組血清中miR-501-5p 的表達水平為（0.88±0.12），乳腺癌患者血清中miR-501-5p的表達水平高于健康對照組，差異有統計學意義（P<0.05）（圖2）。

圖2 乳腺癌組與健康對照組血清中miR-501-5p 表達水平的比較

2.3 乳腺癌組與健康對照組血清腫瘤標志物表達水平的比較

乳腺癌組血清中CEA、CA153、CA125 表達水平高于健康對照組，差異有統計學意義（P<0.05）（表1）。

表1 乳腺癌組與健康對照組血清腫瘤標志物表達水平的比較（±s）

表1 乳腺癌組與健康對照組血清腫瘤標志物表達水平的比較（±s）

注 CEA：癌胚抗原；CA153：糖類抗原153；CA125：糖類抗原125

乳腺癌組健康對照組t 值P 值40 40 4.33±4.72 1.21±0.65 4.182＜0.001 25.31±48.35 9.06±5.10 2.114 0.041 29.17±49.59 10.90±2.95 2.326 0.025組別 例數 CEA（ng/ml） CA153（U/ml）CA125（U/ml）

2.4 不同臨床特征乳腺癌患者血清中miR-501-5p 表達水平的比較

miR-501-5p 在淋巴結轉移、TNM 分期Ⅲ、 Ⅳ期患者中的表達水平高于未發生淋巴結轉移、TNM 分期Ⅰ、Ⅱ期患者，差異有統計學意義（P<0.05）。 乳腺癌患者不同年齡、Her-2、ER、PR 表達情況比較，差異無統計學意義（P>0.05）（表2）。

表2 不同臨床特征乳腺癌患者血清中miR-501-5p 表達水平的比較（±s）

表2 不同臨床特征乳腺癌患者血清中miR-501-5p 表達水平的比較（±s）

注 ER：雌激素受體；PR：孕激素受體；Her-2：人類表皮生長因子受體2

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2.5 LAMTOR5 在乳腺癌組織和癌旁組織中表達情況的比較

運用免疫組化技術檢測LAMTOR5 在癌組織及癌旁組織中的表達情況，LAMTOR5 主要在細胞質中表達，染色呈棕黃色為陽性（圖3）。LAMTOR5 在乳腺癌組織中的陽性表達率為77.5%，高于癌旁組織的陽性率15.0%，差異有統計學意義（P＜0.05）（表3）。

圖3 LAMTOR5 在乳腺癌組織中的表達情況

表3 LAMTOR5 在乳腺癌組織及癌旁組織中表達情況的比較[n（%）]

2.6 MiR-501-5p 表達水平與LAMTOR5 表達情況的相關性

通過Spearman 相關性分析發現，miR-501-5p 在乳腺癌組織中的表達水平與LAMTOR5 的陽性表達呈正相關（P＜0.05）（表4）。

表4 miR-501-5p 表達水平與LAMTOR5 表達情況的相關性

2.7 ROC曲線分析血清中CEA、CA153、CA125、miR-501-5p 在乳腺癌中的診斷價值

為進一步判斷CEA、CA153、CA125 及miR-501-5p 四者對乳腺癌的檢驗診斷效能，用ROC 曲線對四項指標進行分析，結果見圖4、表5。 在四項指標中，CEA 的AUC 最大，CEA、CA153、CA125 及miR-501-5p 四項聯合的AUC 大于CEA、CA153 及CA125 三項聯合診斷。

表5 CEA、CA153、CA125、miR-501-5p 在乳腺癌中的診斷效能

圖4 血清中CEA、CA153、CA125、miR-501-5p 診斷乳腺癌中的ROC 曲線圖

3 討論

據估計，2020年全球發生了1930 萬新癌癥病例，近1000 萬癌癥死亡病例，其中女性乳腺癌已經超過肺癌——成為最常被診斷出的癌癥，約230 萬[8]。乳腺癌的早發現、早診斷是提高乳腺癌患者生存率的重要因素之一。 手術治療、藥物治療及輔助放療等治療手段的逐漸成熟，提高了早期發現患者的生存率。

癌基因和抑癌基因的改變決定了癌癥的發生，這些基因表達可以通過miR 進行調控[9]。 自2002年發現腫瘤抑制性miR 以來， 先后發現多種miR 的失調參與腫瘤發生的啟動，癌癥的進展、侵襲和轉移，其中也包括乳腺癌[10]。 本研究的主要研究對象miR-501-5p 是一種有多種調控作用的非編碼RNA， 可以與多種靶mRNA 的3’非編碼區（3’UTR）結合，調節細胞內多種通路以達到致癌作用[11-12]。 本研究采用qRTPCR 技術檢測了miR-501-5p 的表達情況，乳腺癌組織中miR-501-5p 表達水平高于癌旁組織，差異有統計學意義（P＜0.05）；乳腺癌患者血清中miR-501-5p表達水平高于健康對照人群血清，差異有統計學意義（P＜0.05）。 提示miR-501-5p 在乳腺癌的發生發展中可能起到了致癌作用，可以作為一個潛在的乳腺癌血清學腫瘤標志物。 為進一步了解miR-501-5p 的作用機制， 結合其與乳腺癌臨床病理特征間關系發現，其表達與淋巴結轉移及乳腺癌臨床TNM 分期有關（P＜0.05），與年齡、ER、PR、Her-2 表達均無關（P＞0.05），淋巴結轉移和臨床TNM 分期是提示患者預后不良的指標，miR-501-5p 的表達水平隨著臨床TNM 分期的增加而增加且隨著淋巴結轉移而增加， 這表明miR-501-5p 的高表達可能提示患者乳腺癌病程深甚至發生轉移。大量文獻表明，多種腫瘤標志物的聯合檢測，可以提高乳腺癌的檢出率、降低誤診率[13-14]，再配合影像學檢查，將大大提高乳腺癌的診斷準確性[15-16]。本研究發現，miR-501-5p 與傳統血清學腫瘤標志物CEA、CA153、CA125 四項聯合檢測的診斷效能明顯高于各項單獨診斷乳腺癌的效能，同時也高于CEA、CA153、CA125 三者聯合診斷乳腺癌的診斷效能，這提示四者有望成為一種新的乳腺癌早期診斷標志物組合。

LAMTOR5 在多種癌癥中高表達， 大量研究均表示其與一系列臨床病理特征和不良預后相關[17-20]。 本研究運用免疫組化法對癌組織中LAMTOR5 的表達進行分析，癌組織中的LAMTOR5 陽性表達率明顯高于癌旁組織，差異有統計學意義（P<0.05）,提示其對乳腺癌的發生發展有作用，且miR-501-5p 與LAMTOR5的表達呈正相關， 提示miR-501-5p 可能通過靶向LAMTOR5 對乳腺癌的發生發展起到正向調節作用，但具體靶向方式還有待在日后的研究中加以證實。

綜上所述，miR-501-5p 和LAMTOR5 在乳腺癌中可能起致癌作用。本研究不足之處在于總標本量較小， 且僅初步研究了miR-501-5p 和LAMTOR5 在實驗組及對照組中的差異表達， 未進一步研究miR-501-5p 與其靶標LAMTOR5 的具體作用機制。 若能深入研究兩者的作用方式，miR-501-5p 及LAMTOR5可能為乳腺癌的早期發現及治療提供新思路。