基質栽培黃瓜根際細菌多樣性及促生細菌的篩選

周方園，高云霄，趙曉燕，張廣志，謝雪迎，張新建

（齊魯工業大學（山東省科學院）生態研究所/山東省應用微生物重點實驗室，山東 濟南 250013）

作物根際微生物在植物的生長、營養吸收、病害防御等方面發揮著重要作用［1-4］，尤其一些根際細菌類群，具有較高的固氮、解磷、解鉀和產植物生長素活性［3］。近年來，在作物種植過程中大量使用化學肥料造成土壤氮磷過載和酸化、作物增產受阻，越來越多的科研工作者開始從根際微生物中挖掘、開發新的微生物資源，研發微生物肥料或者制劑來促進作物生長和產量提高［5，6］。作物根際微生物成為分離促生菌的重要來源。

促生菌主要從土壤栽培的健康作物根際分離篩選［7-10］。但隨著現代農業的發展，種植技術不斷更新換代，作物栽培介質也不再局限于土壤，各種人工合成的育苗栽培基質不斷出現［11-13］，作物的根際微生物類群也將隨之發生改變。從土壤栽培作物根際分離到的促生菌在基質栽培條件下可能不能定殖發揮功能。因此，亟需從基質栽培的作物根際篩選新的促生微生物，為開發適應新栽培技術的菌肥或菌劑產品提供菌種資源。

黃瓜是我國大規模種植的重要蔬菜作物，經濟效益巨大。目前受反季蔬菜價格優勢的影響，日光溫室黃瓜種植面積巨大［14-16］，并且越來越多的農戶選擇使用無土基質種植［17，18］，這既能夠減少根部病害的發生，也有利于黃瓜根系延伸，提高肥料利用率，實現黃瓜增產。本研究從山東3地采集基質栽培的設施黃瓜根際樣本，通過16S rRNA高通量測序技術測定黃瓜根際細菌的多樣性，并分離鑒定根際細菌，通過固氮、解磷、產吲哚乙酸、產鐵載體、產ACC脫氨酶活性篩選部分促生菌株；最后通過盆栽試驗驗證菌株的促生活性，以期為開發適應基質栽培黃瓜的菌劑和菌肥產品提供菌種資源，并為未來尋找新的促生菌資源提供支持。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

1.1.1 試劑 10×磷酸鹽緩沖液購自生工生物工程（上海）股份有限公司，用蒸餾水稀釋10倍后滅菌備用；16SrRNA基因擴增引物和Taq聚合酶均購自生工生物工程（上海）股份有限公司；細菌DNA提取試劑盒購自Omega公司；植物基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒購自愛思進生物技術（杭州）有限公司。Salkowski顯色劑：0.5 mol/L FeCl3與35%HClO4體積比按1∶50配制。分析純吲哚乙酸購自國藥集團。PVK無機磷培養基、阿須貝氏培養基、ADF培養基、改良CAS固體培養基、胰蛋白胨大豆肉湯培養基（TSB）購自北京酷來搏科技有限公司。金氏液體培養基按照Glickmann等［19］方法進行配制，加入1%瓊脂制備固體培養基。栽培基質（淀粉樹脂泡沫粒子25%、牛糞秸稈發酵物35%、草炭40%）購自山東商道生物科技股份有限公司。

引物序列：27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，1492R：5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′；799F：5′-AACMGGATTAGATACCCKG-3′，1193R：5′-ACGTCATCCCCACCTTCC-3′。

1.1.2 儀器 PCR儀購自Applied Biosystems公司。NanoDrop 2000微量紫外分光光度計購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司。

1.2 黃瓜根際細菌的高通量測序

1.2.1 測序樣本的制備 2021年1—3月在山東省壽光市（E118.715279°、N36.875423°；山東魯壽農業集團有限公司生產的品種強生719）、蘭陵縣（E116.413384°、N39.910925°；山東魯壽農業集團有限公司生產的品種綠蒂802）、濟南市（E117.101818°、N36.584433°；壽光市旭冉農業科技有限公司生產的品種博盛99）的日光溫室中部每棚采集2株共計6株健康黃瓜，2個樣本相互間隔10 m以上。測序樣本的制備參照Zhang等［20］的方法：采集后剪掉植株地上部分，抖落附著于根部的土壤，剪取部分主根、側根以及不定根約10 g至滅菌50 mL離心管，每采集完一株，剪刀均用75%乙醇消毒并用滅菌水沖洗3次后再使用。采集完畢后，將裝有樣本的離心管置于冰盒內轉運至實驗室。隨后，每個樣品管內加入滅菌1×PBS緩沖液35 mL，置于搖床中180 r/min清洗20 min后，使用無菌濾紙吸干根表面水分，如此反復清洗3次，取0.2 g使用液氮充分研磨，用植物組織DNA提取試劑盒提取微生物總DNA，使用NanoDrop 2000微量紫外分光光度計對提取的DNA進行質量檢驗。

1.2.2 黃瓜根際細菌多樣性高通量測序 使用特異引物799F和1193R擴增根際細菌16SrRNA的V5-V7區，PCR產物5′端添加barcode序列（上海美吉生物醫藥科技有限公司提供）。PCR反應體系（50μL）：DNA模板5μL（10 ng），引物各1.5μL，2 mmol/L dNTPs 5μL，MgSO42μL，10×KOD Buffer 5μL，KOD Plus 1μL，ddH2O補足至50μL。PCR擴增程序：94℃2 min；94℃30 s，63℃30 s，68℃30 s，30個循環；68℃5 min。每個樣品3次重復，將3次PCR產物混合用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒切膠回收PCR產物，送上海美吉生物醫藥科技有限公司進行建庫測序，測序平臺為Illumina Miseq PE250。

1.2.3 黃瓜根際細菌高通量測序數據分析 測序數據使用上海美吉生物醫藥科技有限公司的“生信云”平臺（www.majorbio.com）進行分析。在云平臺中，使用QIIME v.1.9.1（Quantitative Insights Into Microbial Ecology）軟件包對測序數據進行質控檢測和數據分析［21］。數據處理前，剔除測序數據中長度低于200 bp、含有模糊堿基以及引物的錯配數在2個堿基以上的序列。篩選后的序列用USEARCH軟件包中的UPARS按照97%相似性閾值對序列進行OTU聚類［22］，選取豐度最高的序列作為該OTU的代表性序列并使用RDP classifier v.2.2進行分類學分析，使用SILVA數據庫（http：//www.arb-silva.de）將置信閾值設為70%進行分類學注釋［23，24］，統計不同分類水平下各個樣本的OTU組成和reads數。由于測序平臺和注釋數據庫的限制，本試驗中部分序列不能注釋到種，因此根據各序列信息使用FastTree 2.1.3在屬水平構建物種組成的最大似然樹，并統計在屬水平上的reads數作為物種豐度。

1.3 黃瓜根際細菌的分離鑒定

準確稱取1.2.1中清洗后的6份根系樣本各0.2 g加入滅菌1×PBS緩沖液1 mL充分研磨，然后用1×PBS緩沖液10倍梯度稀釋至10-8，每個濃度用移液槍移取50μL滴加到TSA平板上，立即用無菌三角形玻璃涂布棒涂布均勻，待菌液充分吸收后封口膜封口，倒置于28℃培養36 h后，選擇顏色、大小、厚度、透明度和質地不同的菌落，在TSA培養基上用接種環采用三區劃線法進行純化和培養，得到菌株后反復劃線3次得到純菌株。根據菌落形態對菌株進行分組。

選取代表性菌株分別接種至裝有2 mL TSB液體培養基的試管中，28℃、180 r/min培養12 h。之后轉移1 mL菌液到2 mL離心管，13000 r/min離心2 min后收集菌體，使用細菌基因組提取試劑盒提取DNA，隨后用27F和1492R對細菌16S rRNA基因進行擴增。PCR反應體系（25μL）：DNA 1μL（20 ng），引物各0.5μL，2×TaqPCR Buffer 12.5μL，ddH2O 10.5μL。PCR擴增程序：95℃5 min；94℃30 s，52℃30 s，72℃90 s，35個循環；72℃10 min。PCR產物使用1.2%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，片段大小為1500 bp左右的樣品送生工生物工程（上海）股份有限公司測序，平臺為Roche 454。所得序列上傳至GenBank，并與GenBank中親緣關系較近的菌株進行序列比較，選取Anabaena affinis（AF247591）為外群，使用Mega X最大似然法構建系統發育樹（bootstrap值設置為1000）進行細菌的鑒定。

1.4 黃瓜根際細菌中促生細菌的篩選

1.4.1 菌株固氮能力的測定 將分離到的菌株（每個種選一株，下同）用TSB過夜培養，5000 r/min離心5 min后收集菌體，用1×PBS緩沖液反復清洗3遍后制成菌懸液（約108cfu/mL），接種50μL菌懸液至阿須貝氏培養基（培養皿直徑30 mm，下同）上，28℃黑暗條件下培養7 d，觀察菌落的生長狀況，根據菌落直徑大小、菌苔厚度判斷固氮能力。每個菌株3次重復。

1.4.2 菌株解無機磷能力測定 參照1.4.1制備菌懸液，接種50μL菌懸液至PVK無機磷培養基上，28℃黑暗條件下培養7 d，觀察菌落的生長狀況，根據菌落周圍透明圈的大小判斷解磷能力。每個菌株3次重復。

1.4.3 菌株分泌吲哚乙酸能力測定 參照1.4.1制備菌懸液，接種50μL菌懸液至金氏固體培養基中，37℃黑暗培養48 h后，清除平板表面的菌落后，取4 mL Salkowski顯色劑滴加到平板上，25℃避光反應60 min，觀察菌落周圍是否有粉紅色暈圈，暈圈越大、顏色越紅表示產吲哚乙酸能力越強。每個菌株3次重復。

1.4.4 菌株產ACC脫氨酶活性測定 參照1.4.1制備菌懸液，接種50μL菌懸液至ADF培養基上，28℃黑暗條件下培養7 d，觀察菌落的生長狀況，能夠在ADF培養基上生長的菌株即能夠產ACC脫氨酶。菌株生長越快，產ACC脫氨酶活性越強。每個菌株3次重復。

1.4.5 菌株產鐵載體能力的測定 參照1.4.1制備菌懸液，接種50μL菌懸液至CAS培養基平板上，28℃黑暗條件下培養7 d，菌落周圍能夠產生桔黃色暈圈的菌株即能夠產鐵載體。暈圈越大，產鐵載體能力越強。每個菌株3次重復。

1.5 黃瓜根際促生細菌的盆栽驗證

根據1.4試驗結果，選取具有固氮、解磷、產吲哚乙酸、產鐵載體或者產ACC脫氨酶活性的菌株于2021年5月中旬在山東省科學院生態研究所人工溫室（溫度25℃、光周期L∶D=16∶8、光照強度20000 lx）內開展盆栽試驗，驗證菌株對黃瓜幼苗的促生效果。用TSB培養基28℃、180 r/min培養24 h后收集菌體，用無菌水制備各菌株的菌懸液（108cfu/mL）。將滅菌（121℃高壓蒸汽滅菌15 min，反復2次）后的栽培基質用滅菌水充分浸濕后填裝于一次性紙杯內備用。黃瓜種子用稀釋100倍的40%福爾馬林溶液消毒30 min，無菌水反復沖洗3次，于浸濕的滅菌紗布28℃黑暗條件下催芽24 h，選取出芽整齊的種子每個紙杯點播1粒。前期平板活菌計數預試驗表明，在日光溫室條件下基質中萌芽的黃瓜種子表面約有107～109個細菌，因此，本試驗中接種菌懸液1 mL（約108cfu）于紙杯內種子上，表面覆蓋基質后于25℃、光周期L∶D=16∶8培養，出苗后每隔一天澆水10 mL，出苗7 d后測量株高、莖粗、地上和地下部分鮮重。株高：用直尺測量根到生長點的長度（cm）；莖粗：用游標卡尺測量平行于子葉方向子葉下2 cm處（mm）；地上、地下部鮮重采用萬分之一電子天平稱重（g）；地上、地下部干重：將幼苗鮮樣于烘箱105℃殺青15 min后，80℃烘干至恒重，然后用萬分之一電子天平稱重（g）；壯苗指數=（莖粗/株高+地下干重/地上干重）×單株干重。以接種滅菌水為對照，每個菌株6次重復。

1.6 數據處理

使用Microsoft Excel 2019對數據進行整理，使用SPSS 24.0中單因素方差分析（Duncan’s檢驗）對數據進行統計分析，采用Sigmaplot 14.0和R 3.3.1作圖。

2 結果與分析

2.1 基質栽培的黃瓜根際細菌多樣性組成

高通量測序總共得到102159條reads，大部分長度為361～389 bp，平均長度375 bp。經注釋后總共鑒定到64個OTU，分屬于5門6綱16目23科50屬。由圖1可知，所有樣品稀釋曲線均趨于平緩，且樣品α多樣性指數中Coverage指數均大于98.5%，說明本試驗測序數據充分，能夠保證后續分析可靠性。

圖1 6個黃瓜根際樣本的測序稀釋曲線和Coverage指數

如圖2，在屬水平上，豐度較高的屬包括假苯基桿菌屬（Phenylobacterium）、假單胞菌屬（Pseud-omonas）、叢毛單胞菌科某屬（u_Comamonadaceae）、食酸菌屬（Acidovorax）、黃桿菌屬（Flavobacterium）、黃單胞菌科某屬（u_Xanthomonadaceae）、砂單胞菌屬（Arenimonas）、新草螺菌屬（Noviherbaspirillum）、嗜甲基菌屬（Methylophilus）、類芽孢桿菌屬（Paenibacillus）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、根瘤桿菌屬（Rhizobacter）、纖維弧菌屬（Cellvibrio）、快生根瘤菌屬（Rhizobium）、腸桿菌屬（Enterobacter）、德沃斯氏菌屬（Devosia）、嗜糖假單胞菌屬（Pelomonas）、草酸桿菌科某屬（u_Oxalobacteraceae）、甲基營養菌屬（Methyloversatilis）、馬賽菌屬（Massilia）、玫瑰彎菌科某屬（u_Roseiflexaceae），在整個根際細菌群落中所占比例分別為9.92%、8.62%、8.26%、6.07%、4.85%、4.56%、3.54%、3.51%、3.47%、2.83%、2.61%、2.58%、2.37%、2.11%、2.00%、1.74%、1.52%、1.35%、1.27%、1.11%、1.02%、1.01%。

圖2 黃瓜根際細菌中屬水平系統發育樹和測序reads數量

2.2 黃瓜根際細菌的分離鑒定結果

從黃瓜根際共分離到48株細菌，經16S rRNA鑒定屬于26個種，分屬于變形菌門（Proteobacteria，圖3）、厚壁菌門（Firmicutes，圖4a）、擬桿菌門（Bacteroidetes，圖4b）和放線菌門（Actinobacteria，圖4c）的13個屬。26個種的細菌分別為枯草芽孢桿菌（B.subtilis）、根癌農桿菌（Agrobacterium tumefaciens）、產脲節桿菌（Paenarthrobacter ureafaciens）、嗜麥芽窄食單胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）、臺 灣金 黃桿 菌（Chryseobacterium taiwanense）、產吲哚金黃桿菌（C.indologenes）、鏈霉菌（Streptomycessp.）、農業生技所副芽孢桿菌（B.niabensis）、白色假芽孢桿菌（Falsibacillussp.）、環狀芽孢桿菌（B.circulans）、嗜溫鞘氨醇桿菌（Sphingobacterium thalpophilum）、海水芽孢桿菌（B.aquimaris）、黃桿菌的兩個種（Flavobacteriumsp.D9，Flavobacteriumsp.A3、A9）、類產堿假單胞菌（P.pseudoalcaligenes）、德氏食酸菌（Acidovorax delafieldii）、產堿假單胞菌（P.alcaligenes）、曼多辛假單胞菌（P.mendocina）、金黃桿菌（Chryseobacterium sp.）、植物內芽孢桿菌（B.endophyticus）、蠟樣芽孢桿菌（B.cereus）、水原假黃單胞菌（Pseudoxanthomonas suwonensis）、巨大芽孢桿菌（B.megaterium）、干酪棒桿菌（Corynebacterium casei）、常州鞘氨醇桿菌（S.changzhouense）、貝萊斯芽孢桿菌（B.velezensis）。

圖3 分離自黃瓜根際樣本細菌基于16SrRNA基因的系統發育分析

圖4 厚壁菌門（a）、擬桿菌門（b）和放線菌門（c）的系統發育樹

2.3 黃瓜根際促生細菌的篩選結果

如圖5，在固氮菌篩選培養基上菌株D5幾乎不生長，而菌株B3、D3、F5、B4能夠正常生長，說明該4株細菌具有固氮活性，其中以菌株D3和F5的固氮活性較高（表1）。

圖5 黃瓜根際細菌中具有固氮活性的菌株

如圖6，在PVK無機磷培養基上，菌株F4菌落周圍無明顯透明圈，而菌株A2、B3、C9菌落周圍均產生明顯透明圈，其中菌株A2和C9的解磷活性較高（表1）。

圖6 黃瓜根際細菌中具有解無機磷活性的菌株

如圖7，菌株B1在金氏培養基上生長后使用顯色液無紅色出現，說明菌株B1不產吲哚乙酸，而菌株B3、B5、E6平板在染色后出現粉紅色暈圈，說明上述3菌株能夠產生吲哚乙酸（表1）。

圖7 黃瓜根際細菌中具有產吲哚乙酸活性的菌株

如圖8，菌株B4在ADF培養基上幾乎不能生長，而菌株E6、F4、A1、C4、E1、B1、B5、F5、D3能快速生長，說明上述菌株具有產ACC脫氨酶活性，其中以B5、F5、D3活性最高（表1）。

圖8 黃瓜根際細菌中具有產ACC脫氨酶活性的菌株

如圖9，菌株B10和F5在CAS培養基上未產生黃色暈圈，菌株F7、A1、E6、B4、C9、D3、A5、D10菌落周圍均產生明顯黃色暈圈，說明上述菌株具有產鐵載體活性，其中以F7、A1、E6、B4、D10產鐵載體活性較強（表1）。

表1 黃瓜根際細菌中的促生菌株

圖9 黃瓜根際細菌中具有產鐵載體活性的菌株

2.4 根際促生細菌對黃瓜的促生效果

盆栽促生試驗結果表明，不同菌株對黃瓜幼苗的根干重產生顯著影響（表2，one-way ANOVA，F16，85=1.787，P=0.046）。與對照相比，菌株D10、C4、C9顯著提高黃瓜幼苗根部干重約87.2%、74.4%、65.2%，而菌株E6、B4、D3、F4、A2、B3、F7、A1、B1、E1、F5、B5雖能夠提高黃瓜幼苗根干重，但與對照差異不顯著；菌株A5對根干重具有輕微的抑制作用。

不同菌株對黃瓜幼苗的莖干重產生顯著影響（表2，one-way ANOVA，F16，85=1.942，P=0.027），其中菌株C9、F4、D10、A2、B3、F7、E6、D3、E1、A1、B1、C4處理后分別顯著提高黃瓜幼苗莖干重約77.0%、67.9%、66.5%、64.6%、63.5%、56.2%、55.1%、53.4%、53.1%、52.9%、48.2%、45.3%；菌株B5、B4、F5、A5雖提高了黃瓜幼苗的莖干重，但與對照無顯著差異。

不同菌株對黃瓜幼苗的根莖比產生顯著影響（表2，one-way ANOVA，F16，85=3.863，P＜0.001），其中菌株C4處理后顯著提高了黃瓜幼苗根莖比約17.0%，菌株B4、D10雖提高了黃瓜幼苗的根莖比，但與對照無顯著差異；菌株A1、C9、F7、B1、A2、B3、F4、F5、B5、E1、A5均降低了黃瓜幼苗的根莖比，其中菌株A5差異顯著。

黃瓜幼苗植株干重受菌株影響顯著（表2，oneway ANOVA，F16，85=1.830，P=0.040）。菌株C9、D10、F4、A2、B3、E6、F7、D3、A1、C4、E1、B1處理后黃瓜幼苗植株干重顯著增加75.0%、70.1%、65.2%、62.1%、60.9%、55.8%、54.2%、53.6%、51.0%、50.4%、49.2%、46.3%；而菌株B4、B5、F5、A5雖提高了黃瓜植株干重，但與對照差異不顯著。

黃瓜幼苗壯苗指數受菌株影響顯著（表2，Welch’s ANOVA，F16，31.49=1.761，P＜0.001）。菌株D10、C4、C9、E6、B4分別顯著提高黃瓜幼苗壯苗指 數109.7%、95.2%、89.5%、79.0%、75.8%，而菌株F4、D3、A2、B3、B5、F7、A1、B1、E1、F5雖提高了黃瓜幼苗的壯苗指數，但與對照差異不顯著。

表2 不同菌株對黃瓜幼苗根干重、莖干重、根莖比、植株干重、壯苗指數的影響

3 討論

本研究檢測了基質栽培的黃瓜根際細菌組成，豐度較高的屬包括Phenylobacterium、Pseudomonas、Acidovorax、Flavobacterium、Arenimonas、Noviherbaspirillum、Methylophilus、Paenibacillus、Bacillus、Sphingomonas、Rhizobacter、Cellvibrio、Rhizobium、Enterobacter、Devosia等以及一些不能鑒定到屬的細菌（圖2）。上述種類的細菌類群在以往研究中也有報道。例如，Pseudomonas屬在一些溫室黃瓜的根際中檢測到［25，26］，另外，本研究發現的Devosia、Dyella、Flavobacterium、Methyloversatilis、Sphingomonas、Rhizobacter、Acidovorax、Bradyrhizobium、Noviherbaspirillum、Shinella、Pseudomonas等屬細菌在使用基質栽培的黃瓜幼苗根際也有發現［11］。一般來說，植物的根系會分泌特定的分泌物，這些分泌物是根際微生物群落組裝的重要驅動因素。受到這一因素的影響，某些特殊種類的微生物會在植物根際富集，形成根際微生物的核心菌群；但由于栽培介質理化性質、土著菌群的差異及不同栽培模式、環境下的植物根際微生物組存在一定差異［27］。本研究中豐度較高的細菌類群和已經報道的黃瓜根際細菌種類很有可能屬于黃瓜根際細菌的核心菌群，這些菌群在黃瓜生長過程中發揮著重要功能，其中可能存在一些根際促生菌。

本研究使用TSB培養基分離到了黃瓜根際細菌群落中的大部分優勢屬，如Pseudomonas、Acidovorax、Flavobacterium、Bacillus、Sphingomonas等；也有部分優勢屬未分離到，如Phenylobacterium、Arenimonas等。分離作物根際細菌常用的培養基一般包括TSB［20］、NB［28］、LB［6］等，在高通量分離技術中，也有學者使用稀釋后的TSB分離作物根際細菌［20］，其主要目的是分離出生長速度較慢的細菌種類。本研究目的在于從黃瓜根際分離出易培養、生長速度快的細菌種類以便于后期開發應用，因此選取了比較常用的TSB培養基，這也導致未分離到一些生長速度比較慢、對營養成分要求較高的細菌種類。

本研究選用固氮、解無機磷、產IAA、產ACC脫氨酶、產鐵載體5個指標從黃瓜易培養的根際細菌中定性篩選根際促生菌。通過固氮培養基，從黃瓜根際細菌中篩選出固氮菌B.subtilis、B.megaterium、A.delafieldii、A.tumefaciens（表1）。芽孢桿菌屬中多種細菌具有固氮功能，如B.subtilis固氮功能在多種作物如番茄［29］等已有報道，固氮菌B.megaterium在杉木土壤中的豐度也很高［30］。也有研究報道了A.tumefaciens的固氮活性［31］。本研究首次發現A.delafieldii具有固氮活性，之前相關研究只推測這一細菌可能具有固氮活性［32］。本研究共篩選到3株具有解無機磷活性的菌株（表1），其中包括兩株芽孢桿菌B.cereus和B.subtilis，與以往研究一致［33］；已有研究報道Pseudomonas屬細菌具有解磷活性［34］，本研究發現菌株P.alcaligenes具有解磷活性。IAA是重要的植物激素，能夠促進作物生長。本研究從黃瓜根際細菌中共分離到3株具有產IAA活性的菌，分別為B.subtilis、B.megaterium、C.indologenes（表1）。已有研究表明，芽孢桿菌屬中的多個種能夠產生IAA［35］。ACC脫氨酶對多種作物具有顯著的促生作用，這種酶尚未在植物中發現，其主要來源于一些土壤微生物［36］。本研究發現了9種能夠產ACC脫氨酶活性的菌株，其中S.changzhouense、B.megaterium、B.endophyticus、A.delafieldii、S.thalpophilum、C.indologenes、P.ureafaciens、A.tumefaciens產ACC脫氨酶活性已有廣泛報道［37-44］，而細菌C.casei是首次被發現具有產ACC脫氨酶活性。本研究共篩選到8種具有產鐵載體活性的細菌，其中芽孢菌屬的B.subtilis、B.megaterium、B.aquimaris、B.velezensis產鐵載體活性較高，以往也有廣泛報道［45］。此外，與以往報道一致，細菌A.delafieldii［38］、C.indologenes［46］、P.alcaligenes［47］均能夠產生鐵載體。本研究中首次發現S.changzhouense具有產鐵載體活性，以往只在其同屬的一些菌株中有過報道［48］。本研究篩選到的促生細菌如Pseudomonas、Acidovorax、Bacillus和Sphingomonas在黃瓜根際微生物群落中的相對豐度均較高（圖2），與前人研究結果一致［3］。

目前在根際促生菌的開發應用過程中，往往存在田間實際使用效果不穩定的情況。因此本研究在室內開展了盆栽試驗，篩選到部分效果較好的菌株。如菌株D10（B.aquimaris）、C9（P.alcaligenes）、C4（B.endophyticus）對黃瓜幼苗的地上植株、地下根系的生長均具有顯著的促進作用（表2）。Bacillus和Pseudomonas屬細菌是比較常見的根際促生菌，尤其是關于Bacillus屬的促生效果報道較多［49］，關于P.alcaligene的促生效果也有報道［50］，但這些研究往往更加關注菌株本身的促生效果，而沒有關注菌株對不同栽培介質的適應性。本研究表明，Bacillus和Pseudomonas屬細菌在基質栽培的黃瓜根際微生物群落中的相對豐度均較高（圖2），這也暗示這類細菌如果外源添加到基質后可能會在基質栽培的黃瓜根際定殖產生促生效果，具體定殖情況還需要進一步研究。

4 結論

總體來說，菌株D10（B.aquimaris）、C9（P.alcaligenes）、C4（B.endophyticus）對黃瓜幼苗生長均具有顯著的促進作用，并且能夠顯著提高壯苗指數，可以考慮將其作為候選菌株在基質栽培黃瓜中使用。